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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 怎样提高融合蛋白表达量
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 怎样提高融合蛋白表达量 已有6人参与

在BL21菌株中诱导表达蛋白，用的是GST标签，做了几次发现上清里面诱导的蛋白很少，挂柱洗脱后几乎看不见条带。沉淀（包涵体）蛋白还比较多。诱导条件试过IPTG 0.5mM 16度过夜，但IPTG 改成0.3mM 16度过夜后总体诱导表达量就减少了，上清沉淀都少，该怎么解决呢？最后蛋白是要用来测酶活的，所以诱导纯化过程不能破坏酶活。请有经验者帮助！
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1楼 2015-08-02 19:49:25
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
weizhi111: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-08-04 14:44:17
weizhi111: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-08-05 07:57:09
像楼上说的，不知道楼主摇菌转速多少，太快也不好，我们实验室常用170rpm，我也做过几次BL21的GST蛋白提取，加的时0.4mM的IPTG，30度3小时，回收量还不错，还有，根据培养基的组成不同，也会很大程度的影响蛋白产生量，比如，我回收TBP的时候，起初，用的培养基是Tryptone or polypeptone 5g，NaCl  1.25 g，NH4Cl  0.5g，KH2PO4 1.5g，Na2HPO412H2O 4.01g，up to 500ml, 取50ml培养回收，这时效率，上清大概是沉淀的50%（上清含量少），而后，我将培养基改成NaCl 0.5 g，NH4Cl  1g，KH2PO4  3g，Na2HPO412H2O  15g，up to 500ml；用时另外加入：1M MgSO4 1ml，2M Glucose  5.6ml，1% Vitamin B1(thiamine)  1ml，1M CaCl2 0.1ml。取50ml培养回收，反应条件30度2-4小时 OD600:0.4～0.8后加入IPTG，之后16度 24小时，回收TBP效率提高一倍。当然这也只是我做的个例，不能保证适用于所有的蛋白，仅供楼主参考，可以考虑改变下培养基成分，祝楼主早日解决问题。
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7楼2015-08-03 20:13:41
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wufeng1991

新虫 (小有名气)
把iptg改回来不就行了，加到1mM

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-08-02 21:32:35
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-02 21:32:35
把iptg改回来不就行了，加到1mM

可是IPTG浓度大了不是更容易形成包涵体吗？第一次用0.5mM的时候就很多包涵体，上清里面很少。
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3楼2015-08-03 08:40:19
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wufeng1991

新虫 (小有名气)
个人感觉gst促溶能力并不是很好，不如pet32a和sumo,mbp

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2015-08-03 13:11:46
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