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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 怎样提高融合蛋白表达量 已有6人参与

在BL21菌株中诱导表达蛋白,用的是GST标签,做了几次发现上清里面诱导的蛋白很少,挂柱洗脱后几乎看不见条带。沉淀(包涵体)蛋白还比较多。诱导条件试过IPTG 0.5mM 16度过夜,但IPTG 改成0.3mM 16度过夜后总体诱导表达量就减少了,上清沉淀都少,该怎么解决呢?最后蛋白是要用来测酶活的,所以诱导纯化过程不能破坏酶活。请有经验者帮助!
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by ksws0465326 at 2015-08-03 20:13:41
像楼上说的,不知道楼主摇菌转速多少,太快也不好,我们实验室常用170rpm,我也做过几次BL21的GST蛋白提取,加的时0.4mM的IPTG,30度3小时,回收量还不错,还有,根据培养基的组成不同,也会很大程度的影响蛋白产生 ...

非常感谢!你的培养基成分还真复杂,比我们实验室用的复杂多了,我们用的是B培养基,1 L培养基里含有 10g NaCl, 10g 胰蛋白胨, 5g酵母提取物。就这几样,成分很简单,不知道是不是培养基的影响。下次可以考虑试试你的配方。
9楼2015-08-04 14:44:03
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wufeng1991

新虫 (小有名气)

把iptg改回来不就行了,加到1mM

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2015-08-02 21:32:35
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-02 21:32:35
把iptg改回来不就行了,加到1mM

可是IPTG浓度大了不是更容易形成包涵体吗?第一次用0.5mM的时候就很多包涵体,上清里面很少。
3楼2015-08-03 08:40:19
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wufeng1991

新虫 (小有名气)

个人感觉gst促溶能力并不是很好,不如pet32a和sumo,mbp

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2015-08-03 13:11:46
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