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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 怎样提高融合蛋白表达量
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-03 13:11:46
个人感觉gst促溶能力并不是很好，不如pet32a和sumo,mbp

我看32a的图谱含有His,S, Trx三种标签，请问你一般用哪种？
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11楼2015-08-04 14:48:02
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 生物小猴子呢 at 2015-08-04 14:45:57
你可以从IPTG的浓度、诱导的温度、诱导的转速以及诱导时间等条件进行摸索，IPTG浓度过高会使得包涵体含量增加，BL21是大肠杆菌，最适温度37℃，但是建议往下降温度，温度过高合成蛋白速率过快就有可能造成目的蛋白来 ...

我诱导一般16度过夜，温度已经挺低了。请问Transtta(DE3)细胞表达的蛋白可溶性怎样呢？
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12楼2015-08-04 14:53:04
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以如楼上所说的更换载体和宿主细胞来试试。不同的载体对是否在上清表达可能有很大影响。你可以试试MBP标签或SUMO标签。或是试试Transtta(DE3) 表达菌株等等。做蛋白表达有时是可能要试很多才有可能得到自己想要的结果。
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
13楼2015-08-04 15:23:32
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wufeng1991

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by weizhi111 at 2015-08-04 14:48:02
我看32a的图谱含有His,S, Trx三种标签，请问你一般用哪种？...

trxa是促溶的，另外两种是用来纯化的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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14楼2015-08-04 20:24:44
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
bl21并非全能表达系统 尤其是一些分子量较大的真核蛋白 在表达时容易形成包涵体 调整诱导表达条件确实能够提高可溶性表达 但程度有限 可以尝试更换表达系统

[ 发自小木虫客户端 ]
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15楼2015-08-05 07:20:12
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by wufeng1991 at 2015-08-04 20:24:44
trxa是促溶的，另外两种是用来纯化的
...

哦，原来是这样。谢谢，我试试。
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16楼2015-08-05 07:55:45
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by whb21 at 2015-08-05 07:20:12
bl21并非全能表达系统 尤其是一些分子量较大的真核蛋白 在表达时容易形成包涵体 调整诱导表达条件确实能够提高可溶性表达 但程度有限 可以尝试更换表达系统

我的蛋白也不大啊，就30多KD。
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17楼2015-08-05 07:56:30
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ksws0465326 at 2015-08-03 20:13:41
像楼上说的，不知道楼主摇菌转速多少，太快也不好，我们实验室常用170rpm，我也做过几次BL21的GST蛋白提取，加的时0.4mM的IPTG，30度3小时，回收量还不错，还有，根据培养基的组成不同，也会很大程度的影响蛋白产生 ...

请问你破菌时超声一般用什么条件？
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18楼2015-08-05 07:57:51
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cs冰凝 at 2015-08-03 18:56:24
通过变性再复性，这样酶活也可以保证！不知你破菌是用超声还是高压破碎机？

请问你破菌时用什么条件？
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19楼2015-08-05 07:58:17
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ksws0465326

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by weizhi111 at 2015-08-05 07:57:51
请问你破菌时超声一般用什么条件？...

我做的时候，是这样，50ml培养基，菌摇起来OD600 在0.4-0.8后先取出4ml作为Pre－IPTG control，然后剩余的加入IPTG，继续培养，然后回收Past-IPTG sample，离心去上清，加入buffer进行破碎，control加300微 buffer，sample加600微，超声破碎条件是冰上操作，control 5sec/回，sample 10sec/回，间隔10-20sec，8回破碎，然后回收。我回收TBP也是30KD左右，效率还行，就是不知道是否适用于楼主的蛋白了
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20楼2015-08-05 08:29:55
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