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njuzhangxin

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 已知一个基因cDNA全长,6006 bp,想用高保真酶扩增出ORF区,一直扩增不出条带 已有6人参与

已通过race获得一个基因cDNA全长,6006 bp,想用高保真酶扩增出ORF区,一直扩增不出条带。引物没有问题,因为扩增基因组DNA,可以扩增出大约6k多的条带。所以我觉得是RNA反转录成cDNA模板的问题。也查了一下,6k确实太大,有人建议把6k分成几段去扩增,分别去连接转化。想请教一下,扩增大片段基因的ORF区,是否应该用能获得cDNA全长的试剂盒?普通的反转录试剂盒反转录出的cDNA是不是有可能在基因某个位置是断裂的?或者大家有没有比较好的反转录试剂盒可以推荐,谢谢赐教。
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njuzhangxin

铁杆木虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by a314919473 at 2015-07-28 15:13:38
这个和第一链cDNA合成试剂盒有关,建议选择Thermo的K1631 (20次)或者K1621(20次) 可以扩增小鼠13K的片段。

好的,谢谢。
10楼2015-07-30 06:10:41
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:04:37
用好一点的试剂盒,使用oligo dT引物,用高质量的RNA做反应,给够反转录的时间,应该是可以扩增到的。
基因组DNA,可以扩增出大约6k多,那你的ORF应该比基因组DNA扩增到的片段小一点才对呀?(成熟mRNA中内含子是被剪接掉的)
2楼2015-07-24 17:50:52
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great07225388

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:04:43
之前我也遇到这个问题,反正我是没扩增出来。高保真酶扩增速度比taq扩增速度更慢,一个pcr下来,得两个小时了。不建议直接扩增。不过还是可以试试的。

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-07-24 21:43:03
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njuzhangxin

铁杆木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wangpeng227 at 2015-07-24 17:50:52
用好一点的试剂盒,使用oligo dT引物,用高质量的RNA做反应,给够反转录的时间,应该是可以扩增到的。
基因组DNA,可以扩增出大约6k多,那你的ORF应该比基因组DNA扩增到的片段小一点才对呀?(成熟mRNA中内含子是被 ...

对,是应该小一点。有没有好一点试剂盒推荐呢?我之前用过takara的反转录试剂盒,用过全式金的据说制备全长cDNA的反转录试剂盒,用的都是oligo dT的引物,按照说明书的时间做的,没有特意延长反转录时间。另我的RNA做出来,我都会取2 ul加到18 ul水里,然后37 ℃水解一个小时后跑电泳,一般都跑出来28S和18S两条带,亮度1:1左右,没有达到2:1,这样的质量不知道行不行?
4楼2015-07-25 22:39:02
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