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lmc2537

铜虫 (小有名气)

[求助] 设计了两对引物,但是结果不一样已有2人参与

设计了两队引物,但是结果不一样。模板是cDNA,p出来的是不跨内含子的那对引物,P不出来的是跨内含子的那对引物(但是阳性对照P出来了),觉得很奇怪,所以我怀疑是DNA污染,因此我用这个样品p了一个文献上不能表达的基因,如果有基因污染的话,按理说应该P得出来,但是奇怪的是没有P出来(阳性对照P出来了),所以现在不知道到底是什么原因导致的,求大神解答,附图如下:
谢谢

设计了两对引物,但是结果不一样
不跨内含子的引物.jpg


设计了两对引物,但是结果不一样-1
跨内含子.jpg


设计了两对引物,但是结果不一样-2
已知不表达的基因.jpg
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bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-09-08 16:24:27
lmc2537: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-09 10:09:41
lmc2537: 金币+2, 有帮助 2014-09-09 19:59:50
你不跨内含子的引物能扩出来,跨的扩不出来,很可能不是cDNA出问题,而是你引物出问题了,你是按照预测的序列来设计的吧,很可能预测序列和真实序列有点出入导致,要想验证这个想法对不对你可以再外围不跨区域再设计对引物,扩出来后扩个二次就清楚了
2楼2014-09-08 08:34:29
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

你的阴性对照呢? 看一下是不是有引物或者其他污染。
3楼2014-09-08 09:15:45
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lmc2537

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-08 09:15:45
你的阴性对照呢? 看一下是不是有引物或者其他污染。

有空白对照,我没放上去
4楼2014-09-09 10:07:47
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lmc2537

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bwangel at 2014-09-08 08:34:29
你不跨内含子的引物能扩出来,跨的扩不出来,很可能不是cDNA出问题,而是你引物出问题了,你是按照预测的序列来设计的吧,很可能预测序列和真实序列有点出入导致,要想验证这个想法对不对你可以再外围不跨区域再设计 ...

根据什么判断不是cDNA出问题呢
我根据的是参考序列设计的,应该是验证过的,
5楼2014-09-09 10:09:23
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lmc2537(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:55:49
用NC对照就知道是不是DNA污染。
6楼2014-09-09 12:14:42
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lmc2537

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-09 12:14:42
用NC对照就知道是不是DNA污染。

你指的阴性对照,是直接拿提取的RNA作为对照吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-09-09 12:34:50
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lmc2537 at 2014-09-09 12:34:50
你指的阴性对照,是直接拿提取的RNA作为对照吗?
...

没有逆转录酶的RNA样品。
8楼2014-09-09 14:21:51
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bwangel

银虫 (小有名气)

★ ★
lmc2537(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:56:13
引用回帖:
5楼: Originally posted by lmc2537 at 2014-09-09 10:09:23
根据什么判断不是cDNA出问题呢
我根据的是参考序列设计的,应该是验证过的,...

参考序列,顶多也是测序序列,即使品种不同,也可能有一定的变异,你和测序的品种不同,有那么几个变异很正常,如果你怀疑,就和我说的设计个外围引物,然后扩出来去测个序就明白了,跨内含子的区域比较不稳定点,如果你3‘端多点的话,放低温度可能有点效
9楼2014-09-09 15:59:32
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lmc2537

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by bwangel at 2014-09-09 15:59:32
参考序列,顶多也是测序序列,即使品种不同,也可能有一定的变异,你和测序的品种不同,有那么几个变异很正常,如果你怀疑,就和我说的设计个外围引物,然后扩出来去测个序就明白了,跨内含子的区域比较不稳定点, ...

好的,谢谢
10楼2014-09-09 19:58:59
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