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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 已知一个基因cDNA全长，6006 bp，想用高保真酶扩增出ORF区，一直扩增不出条带
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njuzhangxin

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 已知一个基因cDNA全长，6006 bp，想用高保真酶扩增出ORF区，一直扩增不出条带 已有6人参与

已通过race获得一个基因cDNA全长，6006 bp，想用高保真酶扩增出ORF区，一直扩增不出条带。引物没有问题，因为扩增基因组DNA，可以扩增出大约6k多的条带。所以我觉得是RNA反转录成cDNA模板的问题。也查了一下，6k确实太大，有人建议把6k分成几段去扩增，分别去连接转化。想请教一下，扩增大片段基因的ORF区，是否应该用能获得cDNA全长的试剂盒？普通的反转录试剂盒反转录出的cDNA是不是有可能在基因某个位置是断裂的？或者大家有没有比较好的反转录试剂盒可以推荐，谢谢赐教。
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1楼 2015-07-24 17:10:14
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:04:37
用好一点的试剂盒，使用oligo dT引物，用高质量的RNA做反应，给够反转录的时间，应该是可以扩增到的。
基因组DNA，可以扩增出大约6k多，那你的ORF应该比基因组DNA扩增到的片段小一点才对呀？（成熟mRNA中内含子是被剪接掉的）
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2楼2015-07-24 17:50:52
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great07225388

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:04:43
之前我也遇到这个问题，反正我是没扩增出来。高保真酶扩增速度比taq扩增速度更慢，一个pcr下来，得两个小时了。不建议直接扩增。不过还是可以试试的。

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3楼2015-07-24 21:43:03
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njuzhangxin

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangpeng227 at 2015-07-24 17:50:52
用好一点的试剂盒，使用oligo dT引物，用高质量的RNA做反应，给够反转录的时间，应该是可以扩增到的。
基因组DNA，可以扩增出大约6k多，那你的ORF应该比基因组DNA扩增到的片段小一点才对呀？（成熟mRNA中内含子是被 ...

对，是应该小一点。有没有好一点试剂盒推荐呢？我之前用过takara的反转录试剂盒，用过全式金的据说制备全长cDNA的反转录试剂盒，用的都是oligo dT的引物，按照说明书的时间做的，没有特意延长反转录时间。另我的RNA做出来，我都会取2 ul加到18 ul水里，然后37 ℃水解一个小时后跑电泳，一般都跑出来28S和18S两条带，亮度1:1左右，没有达到2:1，这样的质量不知道行不行？
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4楼2015-07-25 22:39:02
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by njuzhangxin at 2015-07-25 22:39:02
对，是应该小一点。有没有好一点试剂盒推荐呢？我之前用过takara的反转录试剂盒，用过全式金的据说制备全长cDNA的反转录试剂盒，用的都是oligo dT的引物，按照说明书的时间做的，没有特意延长反转录时间。另我的RN ...

37℃水解是干什么？直接跑胶就行了。1:1的亮度还是差一点。

我用的是thermo/Fermentas的反转录试剂盒和Phusion DNA聚合酶

扩增不给力的话，可以尝试稍微加点镁离子
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5楼2015-07-26 17:26:11
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jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RNA质量不高，应该是，，，反转录后直接加水，不要取一部分再稀释，，，RNA质量好一点，全部稀释成30，后再P，多P几次，这么大的片段的确不好P，而且高保真酶P的不是很亮，先用普通的酶试着P，条件成熟后再用高保真酶，takara的LaTaq不错，如果高GC含量片段，可以用高GC含量buffer，，，

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借口很贱，，，
6楼2015-07-26 19:47:14
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mm的毛毛

木虫 (正式写手)

科研毛毛虫
分段扩吧，6k分3段扩，应该就很好扩了，最后搭桥PCR连起来就是了。不过基因组扩也6k，这什么情况，这基因没内含子的么？
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好想睡个好觉
7楼2015-07-27 09:52:35
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njuzhangxin

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mm的毛毛 at 2015-07-27 09:52:35
分段扩吧，6k分3段扩，应该就很好扩了，最后搭桥PCR连起来就是了。不过基因组扩也6k，这什么情况，这基因没内含子的么？

有内含子，50 bp，所以基本看不出来。
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8楼2015-07-28 15:09:16
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

这个和第一链cDNA合成试剂盒有关，建议选择Thermo的K1631 （20次）或者K1621(20次) 可以扩增小鼠13K的片段。
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有你真好
9楼2015-07-28 15:13:38
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njuzhangxin

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by a314919473 at 2015-07-28 15:13:38
这个和第一链cDNA合成试剂盒有关，建议选择Thermo的K1631 （20次）或者K1621(20次) 可以扩增小鼠13K的片段。

好的，谢谢。
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10楼2015-07-30 06:10:41
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