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njuzhangxin铁杆木虫 (小有名气)
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已知一个基因cDNA全长，6006 bp，想用高保真酶扩增出ORF区，一直扩增不出条带 已有6人参与
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| 已通过race获得一个基因cDNA全长，6006 bp，想用高保真酶扩增出ORF区，一直扩增不出条带。引物没有问题，因为扩增基因组DNA，可以扩增出大约6k多的条带。所以我觉得是RNA反转录成cDNA模板的问题。也查了一下，6k确实太大，有人建议把6k分成几段去扩增，分别去连接转化。想请教一下，扩增大片段基因的ORF区，是否应该用能获得cDNA全长的试剂盒？普通的反转录试剂盒反转录出的cDNA是不是有可能在基因某个位置是断裂的？或者大家有没有比较好的反转录试剂盒可以推荐，谢谢赐教。 |
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whitewave
至尊木虫 (正式写手)
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- 专业: 肿瘤诊断
【答案】应助回帖
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什么RNA标准的抽提过程和电泳检测楼主看下分子克隆应该都能掌握！个人有个地方没有理解清楚：你目标cDNA的引物为什么能用基因组的引物？基因组引物比cDNA长，那么说明它的引物对必然有一个超过这个cDNA的一个头端，就是有一端都跟cDNA模板不结合，你换什么都不行，除了你有基因组污染！楼主想扩开放读码框应该是想研究这个基因的表达，你得用cDNA序列直接做模板重新设计引物，但是你想把整个读码框都一起一次整体扩增出来连载体里，个人觉得不容易，可以多试试。建议是对序列进行分析找出自己最看中的功能区段序列，把这段扩出来再做载体应该容易操作些。祝你好运 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
11楼2015-07-30 07:15:25