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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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njuzhangxin

超级版主

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[求助] 已知一个基因cDNA全长，6006 bp，想用高保真酶扩增出ORF区，一直扩增不出条带 已有6人参与

已通过race获得一个基因cDNA全长，6006 bp，想用高保真酶扩增出ORF区，一直扩增不出条带。引物没有问题，因为扩增基因组DNA，可以扩增出大约6k多的条带。所以我觉得是RNA反转录成cDNA模板的问题。也查了一下，6k确实太大，有人建议把6k分成几段去扩增，分别去连接转化。想请教一下，扩增大片段基因的ORF区，是否应该用能获得cDNA全长的试剂盒？普通的反转录试剂盒反转录出的cDNA是不是有可能在基因某个位置是断裂的？或者大家有没有比较好的反转录试剂盒可以推荐，谢谢赐教。
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1楼 2015-07-24 17:10:14
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whitewave

超级版主

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【答案】应助回帖

什么RNA标准的抽提过程和电泳检测楼主看下分子克隆应该都能掌握！个人有个地方没有理解清楚：你目标cDNA的引物为什么能用基因组的引物？基因组引物比cDNA长，那么说明它的引物对必然有一个超过这个cDNA的一个头端，就是有一端都跟cDNA模板不结合，你换什么都不行，除了你有基因组污染！楼主想扩开放读码框应该是想研究这个基因的表达，你得用cDNA序列直接做模板重新设计引物，但是你想把整个读码框都一起一次整体扩增出来连载体里，个人觉得不容易，可以多试试。建议是对序列进行分析找出自己最看中的功能区段序列，把这段扩出来再做载体应该容易操作些。祝你好运

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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天生我才
11楼2015-07-30 07:15:25
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wangpeng227

专家顾问

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【答案】应助回帖

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:04:37
用好一点的试剂盒，使用oligo dT引物，用高质量的RNA做反应，给够反转录的时间，应该是可以扩增到的。
基因组DNA，可以扩增出大约6k多，那你的ORF应该比基因组DNA扩增到的片段小一点才对呀？（成熟mRNA中内含子是被剪接掉的）
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2楼2015-07-24 17:50:52
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great07225388

超级版主

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 20:04:43
之前我也遇到这个问题，反正我是没扩增出来。高保真酶扩增速度比taq扩增速度更慢，一个pcr下来，得两个小时了。不建议直接扩增。不过还是可以试试的。

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2015-07-24 21:43:03
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njuzhangxin

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangpeng227 at 2015-07-24 17:50:52
用好一点的试剂盒，使用oligo dT引物，用高质量的RNA做反应，给够反转录的时间，应该是可以扩增到的。
基因组DNA，可以扩增出大约6k多，那你的ORF应该比基因组DNA扩增到的片段小一点才对呀？（成熟mRNA中内含子是被 ...

对，是应该小一点。有没有好一点试剂盒推荐呢？我之前用过takara的反转录试剂盒，用过全式金的据说制备全长cDNA的反转录试剂盒，用的都是oligo dT的引物，按照说明书的时间做的，没有特意延长反转录时间。另我的RNA做出来，我都会取2 ul加到18 ul水里，然后37 ℃水解一个小时后跑电泳，一般都跑出来28S和18S两条带，亮度1:1左右，没有达到2:1，这样的质量不知道行不行？
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4楼2015-07-25 22:39:02
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