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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于实验中可变剪切的一些问题
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 关于实验中可变剪切的一些问题 已有1人参与

各位前辈：我在帮师姐做实验的过程中，遇到了一个问题。在扩增一个基因之后（用cDNA扩增），电泳发现只有一条带，切胶回收后连接T载体，挑菌测序，发现有些片段少了一个内含子，做了几次，挑菌7,8个会有一个，有时候少的内含子还不一样。但是，扩增后跑1%或2%琼脂糖胶只能看到一条带，可变的那条带比目的大小少100多bp，但是胶上就看不到那条带，这是怎么回事啊？在可变的内含子上设计引物倒是能扩出可变的那条带，只是全长就看不到了，是不是可变的比例占得小啊？
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1楼 2015-05-17 08:56:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

随风追梦

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-19 22:48:57
（用cDNA扩增），电泳发现只有一条带，切胶回收后连接T载体，挑菌测序，发现有些片段少了一个内含子——这里如果有内含子，那么含内含子的事一种mRNA,不含的是另一种，这样来说应该是可变剪切；我之前做Race，克了20多个基因吧，也出现3个两种片段的，差别也都不大……不过我的都是在末端差异……有很多种，也挺费解的，Race我做了半年，感觉疑惑挺多的。
“扩增后跑1%或2%琼脂糖胶只能看到一条带，可变的那条带比目的大小少100多bp，但是胶上就看不到那条带，这是怎么回事啊？”如果条带比较大，比如超过2000bp，那么个人认为100bp的差异在琼脂糖中看不出来应该比较正常，我之前克基因的时候，单条带连接转化后，挑菌菌落PCR经常会有分不出的差异……当然不是同一泳道，个人感觉或许你可以试试PAGE……
如有不当请见谅……
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初心不改！
13楼2015-05-18 20:44:56
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普通回帖

810043138
2楼2015-05-17 09:36:40
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阿Q~~

至尊木虫 (文坛精英)
路过的看了一下，帮顶，祝福你好运！~~~~~~~~~~~~~~~~~~
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自强不息，厚德载物；独立精神，自由思想。
3楼2015-05-17 09:38:12
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781055707

木虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
lwk5716: 金币+5, 谢谢你的回答！ 2015-05-17 21:19:26
只要全部条带都得到了，可以考虑做个重叠pcr把要的连起来。

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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-05-17 17:43:38
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wasxnbe
5楼2015-05-17 18:07:12
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xiaochong8693

木虫之王 (文坛精英)
哈哈～飘过～留下满满的祝福
祝福楼主 一切顺利
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6楼2015-05-17 18:30:32
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2015-05-17 17:43:38
只要全部条带都得到了，可以考虑做个重叠pcr把要的连起来。

我疑惑的是发生可变剪切的剪接体为何在琼脂糖胶上分不出两条带来？看带的话只是很亮很粗的一条带，加长跑的时间也是一条带。
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7楼2015-05-17 21:26:46
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-19 22:49:19
有点不明白LZ的意思，你拿cDNA克隆，正常情况下就应该不带内含子的，又何来的少一个内含子一说，是多一个内含子吧。。。7 8个菌会有一个完全不带内含子的正常序列，还是7 8个菌里面会有一个不正常的带内含子的序列？

这种可变剪切在你整个模板中肯定是少见的，所以在你整个PCR扩增过程中较少存在，以至于肉眼看不到带，具体想验证有多大的比例，用你内含子上设计的引物，从你TA克隆的平板上挑上50—100个转化子做个菌落PCR计算一下能扩增出带的转化子数即可推算出大概的比例。
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大家相互帮助哈
8楼2015-05-17 22:50:36
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-17 22:50:36
有点不明白LZ的意思，你拿cDNA克隆，正常情况下就应该不带内含子的，又何来的少一个内含子一说，是多一个内含子吧。。。7 8个菌会有一个完全不带内含子的正常序列，还是7 8个菌里面会有一个不正常的带内含子的序列？ ...

你好，是7 8个菌里面会有一个不正常的带内含子的序列，最初我没表达清楚，谢谢回答。

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9楼2015-05-18 12:53:37
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-17 22:50:36
有点不明白LZ的意思，你拿cDNA克隆，正常情况下就应该不带内含子的，又何来的少一个内含子一说，是多一个内含子吧。。。7 8个菌会有一个完全不带内含子的正常序列，还是7 8个菌里面会有一个不正常的带内含子的序列？ ...

以后想看一下，这种较少的可变剪切对植物的作用是什么，在研究小麦抗旱中找到的。

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10楼2015-05-18 12:59:54
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