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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 关于实验中可变剪切的一些问题已有1人参与

各位前辈：我在帮师姐做实验的过程中，遇到了一个问题。在扩增一个基因之后（用cDNA扩增），电泳发现只有一条带，切胶回收后连接T载体，挑菌测序，发现有些片段少了一个内含子，做了几次，挑菌7,8个会有一个，有时候少的内含子还不一样。但是，扩增后跑1%或2%琼脂糖胶只能看到一条带，可变的那条带比目的大小少100多bp，但是胶上就看不到那条带，这是怎么回事啊？在可变的内含子上设计引物倒是能扩出可变的那条带，只是全长就看不到了，是不是可变的比例占得小啊？

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1楼 2015-05-17 08:56:05

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随风追梦

木虫 (正式写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-19 22:48:57

（用cDNA扩增），电泳发现只有一条带，切胶回收后连接T载体，挑菌测序，发现有些片段少了一个内含子——这里如果有内含子，那么含内含子的事一种mRNA,不含的是另一种，这样来说应该是可变剪切；我之前做Race，克了20多个基因吧，也出现3个两种片段的，差别也都不大……不过我的都是在末端差异……有很多种，也挺费解的，Race我做了半年，感觉疑惑挺多的。
“扩增后跑1%或2%琼脂糖胶只能看到一条带，可变的那条带比目的大小少100多bp，但是胶上就看不到那条带，这是怎么回事啊？”如果条带比较大，比如超过2000bp，那么个人认为100bp的差异在琼脂糖中看不出来应该比较正常，我之前克基因的时候，单条带连接转化后，挑菌菌落PCR经常会有分不出的差异……当然不是同一泳道，个人感觉或许你可以试试PAGE……
如有不当请见谅……