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lwk5716铁杆木虫 (正式写手)
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关于实验中可变剪切的一些问题 已有1人参与
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| 各位前辈：我在帮师姐做实验的过程中，遇到了一个问题。在扩增一个基因之后（用cDNA扩增），电泳发现只有一条带，切胶回收后连接T载体，挑菌测序，发现有些片段少了一个内含子，做了几次，挑菌7,8个会有一个，有时候少的内含子还不一样。但是，扩增后跑1%或2%琼脂糖胶只能看到一条带，可变的那条带比目的大小少100多bp，但是胶上就看不到那条带，这是怎么回事啊？在可变的内含子上设计引物倒是能扩出可变的那条带，只是全长就看不到了，是不是可变的比例占得小啊？ |
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（用cDNA扩增），电泳发现只有一条带，切胶回收后连接T载体，挑菌测序，发现有些片段少了一个内含子——这里如果有内含子，那么含内含子的事一种mRNA,不含的是另一种，这样来说应该是可变剪切；我之前做Race，克了20多个基因吧，也出现3个两种片段的，差别也都不大……不过我的都是在末端差异……有很多种，也挺费解的，Race我做了半年，感觉疑惑挺多的。 “扩增后跑1%或2%琼脂糖胶只能看到一条带，可变的那条带比目的大小少100多bp，但是胶上就看不到那条带，这是怎么回事啊？”如果条带比较大，比如超过2000bp，那么个人认为100bp的差异在琼脂糖中看不出来应该比较正常，我之前克基因的时候，单条带连接转化后，挑菌菌落PCR经常会有分不出的差异……当然不是同一泳道，个人感觉或许你可以试试PAGE…… 如有不当请见谅…… |
13楼2015-05-18 20:44:56
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2楼2015-05-17 09:36:40
阿Q~~
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有点不明白LZ的意思，你拿cDNA克隆，正常情况下就应该不带内含子的，又何来的少一个内含子一说，是多一个内含子吧。。。7 8个菌会有一个完全不带内含子的正常序列，还是7 8个菌里面会有一个不正常的带内含子的序列？ 这种可变剪切在你整个模板中肯定是少见的，所以在你整个PCR扩增过程中较少存在，以至于肉眼看不到带，具体想验证有多大的比例，用你内含子上设计的引物，从你TA克隆的平板上挑上50—100个转化子做个菌落PCR计算一下能扩增出带的转化子数即可推算出大概的比例。 |
8楼2015-05-17 22:50:36
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