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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 关于实验中可变剪切的一些问题已有1人参与

各位前辈：我在帮师姐做实验的过程中，遇到了一个问题。在扩增一个基因之后（用cDNA扩增），电泳发现只有一条带，切胶回收后连接T载体，挑菌测序，发现有些片段少了一个内含子，做了几次，挑菌7,8个会有一个，有时候少的内含子还不一样。但是，扩增后跑1%或2%琼脂糖胶只能看到一条带，可变的那条带比目的大小少100多bp，但是胶上就看不到那条带，这是怎么回事啊？在可变的内含子上设计引物倒是能扩出可变的那条带，只是全长就看不到了，是不是可变的比例占得小啊？

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1楼 2015-05-17 08:56:05

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-19 22:49:19

有点不明白LZ的意思，你拿cDNA克隆，正常情况下就应该不带内含子的，又何来的少一个内含子一说，是多一个内含子吧。。。7 8个菌会有一个完全不带内含子的正常序列，还是7 8个菌里面会有一个不正常的带内含子的序列？

这种可变剪切在你整个模板中肯定是少见的，所以在你整个PCR扩增过程中较少存在，以至于肉眼看不到带，具体想验证有多大的比例，用你内含子上设计的引物，从你TA克隆的平板上挑上50—100个转化子做个菌落PCR计算一下能扩增出带的转化子数即可推算出大概的比例。