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基因组DNA提取问题
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 最近一直在提副溶血弧菌的基因组DNA，但总是提取失败，遇到一些问题。我先说一下我的方法：方法一：（1） 1.5mL菌液（每组两管）4℃ 12000 r/min离心30 s，弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。 （2） 每管加入400 μL裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解，直到液体由浑浊变为澄清，粘度增加，37℃水浴30 min。 （3） 每管加入132 μL的5 M NaCl溶液，颠倒试管，充分混匀后，13000 r/min离心15 min。用粗口的枪头（用剪刀剪去1mL枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的eppendorf管中。 （4） 加入等体积的饱和苯酚/氯仿（24:1），充分混匀后，12000 r/min离心3 min，离心后的水层如混浊则说明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止（约2次）。 （5） 将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀后13000 r/min离心3 min，除去苯酚。 （6） 小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30 min，然后13000 r/min离心15 min，可见白色丝状沉淀物。 （7） 小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400 μL 70％乙醇洗涤2次，室温干燥后，用100-200 μL DEPC水（含20 μg/mL的Rnase）溶解DNA。 裂解液（40 mM Tris-醋酸，20mM醋酸钠,1 mM EDTA,1% SDS,pH 8.0）。 方法二：（1）将待检测菌株接种于 3 mL LB 或 BHI 培养基中，37℃培养过夜； 注： 以生长至对数期的细菌为最佳提取对象， 因为过对数期时培养基中会积聚过度的核酸酶 降解 DNA。 （2）取 1.5 mL 上述菌液于 2 mL 离心管，10,000~15,000 rpm，离心 10~15 min，去 上清（若所得菌体过少可重复此步骤一次） ； （3）加入 564 μL TE 缓冲液（pH 8.0）重悬菌体（可使用无菌牙签充分混合菌体使其 完全重悬） 。 （4）加入 30 μL 10%~20% SDS 和 6 m 蛋白酶 μL（10 mg/mL） ，混合均匀、不得涡 旋，置于 37℃（可用金属浴）条件反应 1~2h，使悬液相对清澈有粘性为止。 （5） 加入 100 μL 5M NaCl， 混合均匀、 不得涡旋， 65℃反应 2 min。 然后， 加入 80 μLCTAB/NaCl，混合均匀、不得涡旋， 65℃反应 10 min。 注：在加入 CTAB/NaCl 之前,必须用 5M NaCl 充分混匀裂解产物，且 CTAB/NaCl 溶液加之 前得先预热至 65℃，并且吸取时移液器枪头应去除尖端。 （6） 加入等体积 （约 800 μL 氯仿/异戊醇（24:1） 充分混匀， ， 10,000 rpm 离心 5 min。 离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液 A）至新的 2 mL 离心管中。 （7）加入等体积（约 800 μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）于上清液 A 中，充分混匀， 15,000 rpm 离心 5 min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液 B） 至新的 2 mL 离心管中。 （8）加入等体积（约 800 μL）氯仿/异戊醇（24:1）于上清液 B 中，充分混匀，10,000 rpm 离心 5 min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液 C）至新的 2 mL 离心管中。 加入用2倍体积无水乙醇沉淀DNA。 现在遇到的问题是当加入SDS进行裂解的时候，总是做不到澄清，也不粘稠，两个方法都是这样（第一个方法本科毕设的时候用的很好，提出来的足够用）。换成大肠杆菌，可以澄清粘稠。但是在加入苯酚/氯仿进行抽提的时候，抽提第二次就上下液层澄清程度让人吃惊，中间也没蛋白层了，后期根本沉淀不出DNA。感觉方法也没有错啊，怎么总是这个样子，有没有熟悉的，想请教一下。都提了接近两周了。 |
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