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BugBuster细胞破碎液的使用方法 已有1人参与
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| Novagen公司的试剂盒去哪找说明书？ |
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【答案】应助回帖
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· BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法 BugBuster Master Mix（货号71456）是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme™溶菌酶溶液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预混形式的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100 mL和500 mL包装分别足够用于20 g和100 g细胞沉淀的可溶蛋白抽提。 可溶蛋白制备 采用此操作抽提到的蛋白包括来自细胞周质和细胞质的可溶蛋白。如果欲仅收集周质部分蛋白，可以参考Novagen的TB055“PET系统操作手册”中提到的渗压休克方法或其它合适的方法。渗透休克方法中得到的沉淀也可以用于以下操作以获得细胞质中的可溶蛋白。 1.用经预先称重的离心管10,000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1.5 mL或更少），可以用1.5 mL离心管14,000–16,000g离心。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。 2.室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5 mL抽提试剂。这相当于50 mL培养液采用2.5 mL抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀（例如，1.5 mL培养液采用300 μL抽提试剂）。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。 选做：加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号 69671），Xa因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。除尽纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。 3.室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10-20分钟。 注意：孵育后获得的抽提物不是粘稠的。 4.4℃下16,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明）的材料。 5.将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂（以及其它很多类似纯化系统）。蛋白溶液在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋白经冻融会失活。 高纯度包涵体的制备 以下操作可用于任何 BugBuster®系列产品抽提的包涵体纯化。 1.如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。 2.将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster（货号70584），BugBuster的量与当初重悬细胞糊的体积相同。吸打并涡旋以获得均匀的悬浮液。充分重悬沉淀能够溶解、去除杂蛋白以获得高纯度的包涵体。 3.加入rLysozyme™溶液至终浓度为1KU/mL。温和涡旋混匀，室温孵育5分钟。 注意：如果采用的是BugBuster Master Mix就不需要另加rLysozyme了（即可省去此步操作）。 4.加入6倍体积的经1:10去离子水稀释的BugBuster重悬，涡旋1分钟混匀。 5.于4℃，5,000g离心15分钟，以吸管移去上清，收集包涵体。 6.将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1:10稀释的BugBuster中，涡旋混匀，如步骤5离心。此步骤重复两次。再次重悬，于4℃，16,000g离心15分钟并去除上清。 7.重悬最终的沉淀（即纯化的包涵体）于选定的缓冲液，最好是能与后续纯化方法兼容的缓冲液。包涵体可以重悬于Novagen的蛋白重折叠试剂盒（货号70123）中的1×溶解缓冲液（参考操作手册TB234）或其它变性剂。不溶的His•Tag®融合蛋白可以用含有变性剂的1×结合缓冲液重悬用于His•Bind®纯化（IDA或NTA）。 |
2楼2019-03-08 20:48:07
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