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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

[求助] 转化相关问题-无法转化成功已有8人参与

最近做转化,一直转化不成功!酶切用的是BamHI 和EcoRI ,质粒是PET-28a,宿主是大肠,做了好几批转化了,转化的平板就是没有菌。我将感受态涂布,平板上不长菌,转化空载,平板上会有很多菌,说明感受态没问题吧。我进行双酶切验证,酶也没问题,我对目的基因进行双酶切并纯化后,进行跑胶,有条带,说明是有目的基因的。接下来只有连接酶了,接连两次用的都是新酶,转化的平板上就是没有菌落,这是为什么?我的思路错哪了?实验一直没有进展,急!
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lomis

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-03-22 15:51:49
思路没有问题,如果你切好了,连接一般不会有问题,所以还是目的片段酶切的效果。
你有没有注意保护碱基的添加? 载体上两边是有序列的,但是基因上单纯PCR的话是需要添加保护碱基的。
Fermentas的酶有标注几个保护碱基有什么样的酶切效果,你可看一下。
没有命运,只有选择!
8楼2015-03-17 15:30:06
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
空载切的怎么样?把你的酶切体系拿上来看看,最好基因,载体浓度贴上。这个载体我也做过,很是奇怪的。我之前遇到的是切过的空载比未切的跑的还快

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
16楼2015-03-19 22:45:41
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普通回帖

qiaobethy

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
LZ试一下换一下酶切的酶。感觉问题是酶的问题。
屈从于现实的温暖
2楼2015-03-17 09:11:08
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉原因只有一个了,就是你的目的片段切不动。
采菊东篱下,悠然见南山。
3楼2015-03-17 09:26:00
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by qiaobethy at 2015-03-17 09:11:08
LZ试一下换一下酶切的酶。感觉问题是酶的问题。

弱弱的问,LZ是什么东东?双酶切验证的时候没有问题啊,酶切可以切开的
4楼2015-03-17 09:26:41
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-17 09:26:00
感觉原因只有一个了,就是你的目的片段切不动。

怎样才能明确确定目的片段切不动?
5楼2015-03-17 11:05:26
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qiaobethy

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by yuman0709 at 2015-03-17 09:26:41
弱弱的问,LZ是什么东东?双酶切验证的时候没有问题啊,酶切可以切开的...

lz =楼主
屈从于现实的温暖
6楼2015-03-17 13:02:40
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by qiaobethy at 2015-03-17 13:02:40
lz =楼主...

还以为是什么酶呢!傻掉了。。。
7楼2015-03-17 15:15:53
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qiaobethy

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by yuman0709 at 2015-03-17 15:15:53
还以为是什么酶呢!傻掉了。。。...

9楼2015-03-17 17:19:52
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
会不会是切胶回收用的试剂盒有问题,切胶回收后影响了链接,你换个试剂盒试试。
10楼2015-03-18 15:54:29
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