【答案】应助回帖

11楼2015-03-18 16:35:05

紫玉涵轩

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【答案】应助回帖

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我也遇到过不长菌的情况，做了不下十次，最多有2个菌，师兄说可能是我的片段对大肠杆菌有毒性作用，不知道你是不是这个原因啊？

12楼2015-03-18 17:44:55

yuman0709

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12楼: Originally posted by 紫玉涵轩 at 2015-03-18 17:44:55
我也遇到过不长菌的情况，做了不下十次，最多有2个菌，师兄说可能是我的片段对大肠杆菌有毒性作用，不知道你是不是这个原因啊？

对的，目的基因表达的蛋白是有毒的，但我曾经转化成功过，其他人也能转化成功。我其实主要是想通过对易错PCR条件进行摸索，来确定一个条件，进行提高酶活或产量的，但就是卡在这里了，一直转化未成功，不知怎么办，对易错PCR条件进行摸索，进行了好几个月了，一直没有进展。。。该怎么办？

13楼2015-03-19 22:04:24

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11楼: Originally posted by 苍雨果果 at 2015-03-18 16:35:05
我觉得问题应该出在目的片段上，有条件的话可以去测个序

直接用PCR产物进行测序？我本意就是让目的基因发生突变的，直接PCR产物测序没什么意义啊

14楼2015-03-19 22:06:13

yuman0709

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后来你是怎么解决的？？？

15楼2015-03-19 22:06:40

随风飘摇11

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【答案】应助回帖

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空载切的怎么样？把你的酶切体系拿上来看看，最好基因，载体浓度贴上。这个载体我也做过，很是奇怪的。我之前遇到的是切过的空载比未切的跑的还快

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16楼2015-03-19 22:45:41

kingjazz23

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你好我想问问怎么确定目的片段对宿主有没有毒性

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17楼2016-05-25 17:49:05

原海亮

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【答案】应助回帖

pet系列载体还是比较常用的，所以克隆构建相对比较容易，首先，平板抗性问题，当然相信楼主不会加错抗的。其次，载体酶切处理问题，不知道楼主出发载体是pet空载，还是携带有外源片段的，如果是空载，那么进行酶切是还是要注意酶切的彻底性，当然看楼主的实验结果，有两种可能，一种是你的载体处理的很彻底，以至于连接不成功的情况下，也不会有空载克隆生长，这样的载体处理是最理想的，问题可能就是其他方面了，另一种就是你的载体酶切回收出现问题，不知道载体酶切完，有没有做电泳检测载体片段，有可能压根你的载体浓度就非常低，这样载体无论酶切是否完全，都可能导致连一个克隆都没长。实验室中，像pet系列这种常用载体，我们都会选择已经连有插入片段的来作为出发载体，相对于空载来说，这种载体进行酶切可以很直观的依据是否有插入片段切出来判断酶切的彻底性，而空载双酶切和酶切不完全的单酶切在电泳图上是体现不出来的。然后是片段的处理了，同样是酶切问题，不知道你的片段是不是pcr产物，你实验中只是检测有目的片段条带，但是片段双酶切的效果是看不出来的，所以同载体一样，酶切是否彻底以及酶切完回收片段是否成功。最后就是连接体系，这个你就要参考你片段和载体的浓度来适当的调整，这样一步步下去，拿到几个正确克隆应该不是问题，至少不会一个菌落都不长。，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！

18楼2016-05-25 22:25:57