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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 转化相关问题-无法转化成功已有8人参与

最近做转化，一直转化不成功！酶切用的是BamHI 和EcoRI ，质粒是PET-28a，宿主是大肠，做了好几批转化了，转化的平板就是没有菌。我将感受态涂布，平板上不长菌，转化空载，平板上会有很多菌，说明感受态没问题吧。我进行双酶切验证，酶也没问题，我对目的基因进行双酶切并纯化后，进行跑胶，有条带，说明是有目的基因的。接下来只有连接酶了，接连两次用的都是新酶，转化的平板上就是没有菌落，这是为什么？我的思路错哪了？实验一直没有进展，急！

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1楼 2015-03-17 09:06:12

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原海亮

木虫 (著名写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

pet系列载体还是比较常用的，所以克隆构建相对比较容易，首先，平板抗性问题，当然相信楼主不会加错抗的。其次，载体酶切处理问题，不知道楼主出发载体是pet空载，还是携带有外源片段的，如果是空载，那么进行酶切是还是要注意酶切的彻底性，当然看楼主的实验结果，有两种可能，一种是你的载体处理的很彻底，以至于连接不成功的情况下，也不会有空载克隆生长，这样的载体处理是最理想的，问题可能就是其他方面了，另一种就是你的载体酶切回收出现问题，不知道载体酶切完，有没有做电泳检测载体片段，有可能压根你的载体浓度就非常低，这样载体无论酶切是否完全，都可能导致连一个克隆都没长。实验室中，像pet系列这种常用载体，我们都会选择已经连有插入片段的来作为出发载体，相对于空载来说，这种载体进行酶切可以很直观的依据是否有插入片段切出来判断酶切的彻底性，而空载双酶切和酶切不完全的单酶切在电泳图上是体现不出来的。然后是片段的处理了，同样是酶切问题，不知道你的片段是不是pcr产物，你实验中只是检测有目的片段条带，但是片段双酶切的效果是看不出来的，所以同载体一样，酶切是否彻底以及酶切完回收片段是否成功。最后就是连接体系，这个你就要参考你片段和载体的浓度来适当的调整，这样一步步下去，拿到几个正确克隆应该不是问题，至少不会一个菌落都不长。，祝好！

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