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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

[求助] 转化相关问题-无法转化成功已有8人参与

最近做转化,一直转化不成功!酶切用的是BamHI 和EcoRI ,质粒是PET-28a,宿主是大肠,做了好几批转化了,转化的平板就是没有菌。我将感受态涂布,平板上不长菌,转化空载,平板上会有很多菌,说明感受态没问题吧。我进行双酶切验证,酶也没问题,我对目的基因进行双酶切并纯化后,进行跑胶,有条带,说明是有目的基因的。接下来只有连接酶了,接连两次用的都是新酶,转化的平板上就是没有菌落,这是为什么?我的思路错哪了?实验一直没有进展,急!
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 紫玉涵轩 at 2015-03-18 17:44:55
我也遇到过不长菌的情况,做了不下十次,最多有2个菌,师兄说可能是我的片段对大肠杆菌有毒性作用,不知道你是不是这个原因啊?

对的,目的基因表达的蛋白是有毒的,但我曾经转化成功过,其他人也能转化成功。我其实主要是想通过对易错PCR条件进行摸索,来确定一个条件,进行提高酶活或产量的,但就是卡在这里了,一直转化未成功,不知怎么办,对易错PCR条件进行摸索,进行了好几个月了,一直没有进展。。。该怎么办?
13楼2015-03-19 22:04:24
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qiaobethy

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
LZ试一下换一下酶切的酶。感觉问题是酶的问题。
屈从于现实的温暖
2楼2015-03-17 09:11:08
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉原因只有一个了,就是你的目的片段切不动。
采菊东篱下,悠然见南山。
3楼2015-03-17 09:26:00
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by qiaobethy at 2015-03-17 09:11:08
LZ试一下换一下酶切的酶。感觉问题是酶的问题。

弱弱的问,LZ是什么东东?双酶切验证的时候没有问题啊,酶切可以切开的
4楼2015-03-17 09:26:41
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