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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化相关问题-无法转化成功
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)

[求助] 转化相关问题-无法转化成功 已有8人参与

最近做转化，一直转化不成功！酶切用的是BamHI 和EcoRI ，质粒是PET-28a，宿主是大肠，做了好几批转化了，转化的平板就是没有菌。我将感受态涂布，平板上不长菌，转化空载，平板上会有很多菌，说明感受态没问题吧。我进行双酶切验证，酶也没问题，我对目的基因进行双酶切并纯化后，进行跑胶，有条带，说明是有目的基因的。接下来只有连接酶了，接连两次用的都是新酶，转化的平板上就是没有菌落，这是为什么？我的思路错哪了？实验一直没有进展，急！
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1楼 2015-03-17 09:06:12
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lomis

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuman0709(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-03-22 15:51:49
思路没有问题，如果你切好了，连接一般不会有问题，所以还是目的片段酶切的效果。
你有没有注意保护碱基的添加？ 载体上两边是有序列的，但是基因上单纯PCR的话是需要添加保护碱基的。
Fermentas的酶有标注几个保护碱基有什么样的酶切效果，你可看一下。
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没有命运，只有选择！
8楼2015-03-17 15:30:06
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qiaobethy

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
LZ试一下换一下酶切的酶。感觉问题是酶的问题。
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屈从于现实的温暖
2楼2015-03-17 09:11:08
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉原因只有一个了，就是你的目的片段切不动。
赞一下 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-03-17 09:26:00
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qiaobethy at 2015-03-17 09:11:08
LZ试一下换一下酶切的酶。感觉问题是酶的问题。

弱弱的问，LZ是什么东东？双酶切验证的时候没有问题啊，酶切可以切开的
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4楼2015-03-17 09:26:41
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