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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Nde1和BamH1双酶切问题求助
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guaidiandian

新虫 (小有名气)

[求助] Nde1和BamH1双酶切问题求助 已有5人参与

本人用PRI101AN构建过表达载体，选用的内切酶是Nde1和BamH1，Buffer用的是Tango，体系是质粒/目的片段22微升，Buffer6微升，内切酶各一微升，37度酶切10小时左右，然后用连接酶连接，但是做了几次转化都没有出现菌落，不知啥地方出现在了问题，求助大神~~~~
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1楼 2015-02-01 12:56:07
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still2008

至尊木虫 (著名写手)

破碎世界的守护者

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
电转化吗？感受态细胞有没有问题？有没有阳性对照？

[ 发自小木虫客户端 ]
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有时一本正经，有时胡言乱语。
2楼2015-02-01 13:12:50
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guaidiandian

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by still2008 at 2015-02-01 13:12:50
电转化吗？感受态细胞有没有问题？有没有阳性对照？

转化DH5a大肠杆菌，阳性对照没有问题长了满满一板子。
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3楼2015-02-01 13:16:39
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是图谱上NdeI 和BamHI酶切位点离得太近了？如果离得太近了就分开切试试看。
祝顺利！
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4楼2015-02-01 14:01:31
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浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确定切开了吗？如果都是线性的应该可以连接上呀，会不会是连接酶有问题呢？
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5楼2015-02-02 12:28:17
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
guaidiandian(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-02-02 21:11:54
本人用PRI101AN构建过表达载体，选用的内切酶是Nde1和BamH1，
1, 确定载体里没有这两个酶的酶切位点

Buffer用的是Tango，
2.确定这个BUFFER是两个酶通用

体系是质粒/目的片段22微升，Buffer6微升，
3. 确定质粒和片段总量配比合适，而不是以体积描述

内切酶各一微升，37度酶切10小时左右
4，说明书上要求酶切这么长时间吗？？

5，没有菌落，说明没有连上，可能是，酶切没问题，但是连接酶有问题，也可能是最开始构建载体时载体就有问题
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6楼2015-02-02 12:58:41
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zoe_张

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-24 09:18:19
1.酶切体系：酶切体系应该根据你质粒的浓度来，你22ul的质粒是多少ug，还有酶切时间10小时，是说明书上说的吗？你用的BamHI酶是什么牌子的，一般那么长时间的酶切可能导致星活性，反倒把非特异性位点也给切了
2.酶切以后有回收酶切产物吗，有电泳看大小是否和你目的片段一致吗？
3.连接的体系是怎样的，载体和目的片段各是多少？
连接条件是怎样，一般连接效率不高的时候可以试下，4度连接过夜
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7楼2015-03-24 09:02:01
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
8楼2016-03-25 11:20:41
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