应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Nde1和BamH1双酶切问题求助
81/1返回列表
查看: 5557  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

guaidiandian

新虫 (小有名气)

[求助] Nde1和BamH1双酶切问题求助 已有5人参与

本人用PRI101AN构建过表达载体，选用的内切酶是Nde1和BamH1，Buffer用的是Tango，体系是质粒/目的片段22微升，Buffer6微升，内切酶各一微升，37度酶切10小时左右，然后用连接酶连接，但是做了几次转化都没有出现菌落，不知啥地方出现在了问题，求助大神~~~~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-02-01 12:56:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

still2008

至尊木虫 (著名写手)

破碎世界的守护者

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
电转化吗？感受态细胞有没有问题？有没有阳性对照？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
有时一本正经，有时胡言乱语。
2楼2015-02-01 13:12:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guaidiandian

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by still2008 at 2015-02-01 13:12:50
电转化吗？感受态细胞有没有问题？有没有阳性对照？

转化DH5a大肠杆菌，阳性对照没有问题长了满满一板子。
赞一下 回复此楼
3楼2015-02-01 13:16:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是图谱上NdeI 和BamHI酶切位点离得太近了？如果离得太近了就分开切试试看。
祝顺利！
赞一下 回复此楼
4楼2015-02-01 14:01:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确定切开了吗？如果都是线性的应该可以连接上呀，会不会是连接酶有问题呢？
赞一下 回复此楼
5楼2015-02-02 12:28:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
guaidiandian(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-02-02 21:11:54
本人用PRI101AN构建过表达载体，选用的内切酶是Nde1和BamH1，
1, 确定载体里没有这两个酶的酶切位点

Buffer用的是Tango，
2.确定这个BUFFER是两个酶通用

体系是质粒/目的片段22微升，Buffer6微升，
3. 确定质粒和片段总量配比合适，而不是以体积描述

内切酶各一微升，37度酶切10小时左右
4，说明书上要求酶切这么长时间吗？？

5，没有菌落，说明没有连上，可能是，酶切没问题，但是连接酶有问题，也可能是最开始构建载体时载体就有问题
赞一下 回复此楼
6楼2015-02-02 12:58:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zoe_张

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-24 09:18:19
1.酶切体系：酶切体系应该根据你质粒的浓度来，你22ul的质粒是多少ug，还有酶切时间10小时，是说明书上说的吗？你用的BamHI酶是什么牌子的，一般那么长时间的酶切可能导致星活性，反倒把非特异性位点也给切了
2.酶切以后有回收酶切产物吗，有电泳看大小是否和你目的片段一致吗？
3.连接的体系是怎样的，载体和目的片段各是多少？
连接条件是怎样，一般连接效率不高的时候可以试下，4度连接过夜
赞一下 回复此楼
7楼2015-03-24 09:02:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

-字仲康

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
8楼2016-03-25 11:20:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 guaidiandian 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 4/200 2026-08-23 15:30 by KM5EcsNQRBPn
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 8/400 2026-08-23 14:30 by KM5EcsNQRBPn
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 h4CP7TrQR8Lg 2026-08-22 5/250 2026-08-23 12:09 by LR9qGULyN2ew
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 07:41 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 10/500 2026-08-23 07:17 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 4/200 2026-08-23 04:04 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 03:52 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +3 zjuhero 2026-08-22 4/200 2026-08-22 20:02 by mycsru
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭