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guaidiandian

新虫 (小有名气)

[求助] Nde1和BamH1双酶切问题求助 已有5人参与

本人用PRI101AN构建过表达载体,选用的内切酶是Nde1和BamH1,Buffer用的是Tango,体系是质粒/目的片段22微升,Buffer6微升,内切酶各一微升,37度酶切10小时左右,然后用连接酶连接,但是做了几次转化都没有出现菌落,不知啥地方出现在了问题,求助大神~~~~
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zoe_张

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-24 09:18:19
1.酶切体系:酶切体系应该根据你质粒的浓度来,你22ul的质粒是多少ug,还有酶切时间10小时,是说明书上说的吗?你用的BamHI酶是什么牌子的,一般那么长时间的酶切可能导致星活性,反倒把非特异性位点也给切了
2.酶切以后有回收酶切产物吗,有电泳看大小是否和你目的片段一致吗?
3.连接的体系是怎样的,载体和目的片段各是多少?
连接条件是怎样,一般连接效率不高的时候可以试下,4度连接过夜
7楼2015-03-24 09:02:01
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still2008

至尊木虫 (著名写手)

破碎世界的守护者

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
电转化吗?感受态细胞有没有问题?有没有阳性对照?

[ 发自小木虫客户端 ]
有时一本正经,有时胡言乱语。
2楼2015-02-01 13:12:50
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guaidiandian

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by still2008 at 2015-02-01 13:12:50
电转化吗?感受态细胞有没有问题?有没有阳性对照?

转化DH5a大肠杆菌,阳性对照没有问题长了满满一板子。
3楼2015-02-01 13:16:39
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是图谱上NdeI 和BamHI酶切位点离得太近了?如果离得太近了就分开切试试看。
祝顺利!
4楼2015-02-01 14:01:31
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