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guaidiandian

新虫 (小有名气)

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[求助] Nde1和BamH1双酶切问题求助已有5人参与

本人用PRI101AN构建过表达载体，选用的内切酶是Nde1和BamH1，Buffer用的是Tango，体系是质粒/目的片段22微升，Buffer6微升，内切酶各一微升，37度酶切10小时左右，然后用连接酶连接，但是做了几次转化都没有出现菌落，不知啥地方出现在了问题，求助大神~~~~

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关于T7－Tag？已经有8人回复

1楼 2015-02-01 12:56:07

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zoe_张

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-24 09:18:19

1.酶切体系：酶切体系应该根据你质粒的浓度来，你22ul的质粒是多少ug，还有酶切时间10小时，是说明书上说的吗？你用的BamHI酶是什么牌子的，一般那么长时间的酶切可能导致星活性，反倒把非特异性位点也给切了
2.酶切以后有回收酶切产物吗，有电泳看大小是否和你目的片段一致吗？
3.连接的体系是怎样的，载体和目的片段各是多少？
连接条件是怎样，一般连接效率不高的时候可以试下，4度连接过夜