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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 启动子克隆结果总有突变
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childchou

银虫 (小有名气)

[求助] 启动子克隆结果总有突变 已有2人参与

请教下各位高人，我克隆一个启动子2000bp，开始用普通Taq酶扩增大面积突变，之后就试过好几种高保真酶扩增，但是都有2-3个碱基突变，有一个是与NCBI上我的目的序列相比，突变了一个然后分别多一个和少一个碱基，所以大小是一样的，师兄说可以去PLANTCARE
分析，结果NCBI上序列和我扩出来的序列分析出的各种作用元件什么的都是一模一样的，没有多也没有少，那我能直接用我扩出来的这个序列吗？会对后面实验有影响吗？
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boomshakalaka
1楼 2014-12-18 16:32:04
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-18 22:42:34
元件没有变化，那就直接用吧。
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2楼2014-12-18 21:37:25
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gangouyang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-18 22:42:42
childchou: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-12-19 09:32:18
解决方案：请把用高保真酶P出来的目的片段，连成质粒，送3个样品测序（如果经济条件允许，可多测几个），比较这3个样品的序列，如果序列差别不大，个别碱基的差异，请保留出现比例高的质粒用于你的后续实验。下面解释一下原因，因为你提取的基因组是个mix，本身就很复杂，但你测序又是单clone，所以会出现一些不一致的地方，所以就需要你通过几个clone测序来确定你实验对象的序列。另外，如果你非要迷信NCBI数据库里面的序列，可用定点突变的方法把你认为不对的地方全部都变成跟NCBI数据库里面的序列一致，再进行后续实验。顺便说一句，NCBI数据库里面的信息是需要更新的，有时候N久都没更新，所以需要通过广大苦逼的生物科研工作人员的实验数据去更新它。我的建议希望对楼主有所帮助。
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3楼2014-12-18 22:03:09
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