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xpb2005

银虫 (小有名气)

[求助] 拟南芥突变体问题

我有一个A基因的突变体   鉴定为纯合突变体,   本来我设计了一对这个基因的引物做定量PCR用,  但我用这对引物去扩增这个基因的纯合突变体时(模板为cDNA,提RNA时加了DNAase I 处理),也扩增出了一条目的带,送去测序,结果是这段序列是A基因的一段序列。但我理解突变体是纯合的T-DNA插入突变,应该没有这个基因的mRNA存在的呀,怎么一做反转录后扩增可以扩增出这个基因,不理解?求高手指点?
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能是T-DNA插入突变对这个基因的转录没有影响,把整个插入当作异常蛋白给剪掉了。
我做的毕业论文也是这种情况,实在找不到原因了,师兄就给了我以上的解释。

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你的日子如何,你的力量也必如何!
2楼2012-01-11 15:46:23
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xpb2005

银虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by sxxuan at 2012-01-11 15:46:23:
可能是T-DNA插入突变对这个基因的转录没有影响,把整个插入当作异常蛋白给剪掉了。
我做的毕业论文也是这种情况,实在找不到原因了,师兄就给了我以上的解释。

如果转录不受影响的话,用此基因的全长引物扩增,以突变体的cDNA为模板,没有扩出带,这合理吗?
3楼2012-01-12 19:27:01
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

T-DNA插入位点如何?是在外显子还是内含子?如果是外显子的话,是靠近启动子的5‘端还是3’端?如果插入靠近3‘端,那么之前的转录可能是不受影响的,如果你设计的引物是根据不受影响的序列来设计的,那当然可以扩出来,但用全长引物,由于下游序列被突变了,所以不能扩增全长。
如果是上述的情况,你订购突变体的时候应该把所以对突变株都买回来,实在不行,也得换个定量PCR的引物,尽量以突变了的序列来设计。
不过我觉得这样其实是选择了对自己有利的数据,并不是这个突变体的所有真实情况的反映,也比较难解释突变体的表型之类的。
你的日子如何,你的力量也必如何!
4楼2012-01-13 09:31:34
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秋lover

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主,虽然我不能回答你的问题,但是我想向你请教一下,突变数据是关于什么类型的数据啊?除了序列数据外,还有什么其它类型的数据吗?
有public能获取的吗?
我要做一个勇敢的女子,要用自己的力量,立足于这个城市!!!
5楼2013-01-24 20:24:40
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xpb2005

银虫 (小有名气)

wizardfan: 请问你问题已解决没有?有的话,请对应助内容及时反馈是否有帮助(金币奖励) 2013-01-28 07:08:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by 秋lover at 2013-01-24 20:24:40
楼主,虽然我不能回答你的问题,但是我想向你请教一下,突变数据是关于什么类型的数据啊?除了序列数据外,还有什么其它类型的数据吗?
有public能获取的吗?

关于你说的突变数据我不太明白你的意思,能说具体点吗?
6楼2013-01-26 20:21:10
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秋lover

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

关于有突变信息的数据,嗯,就是这个意思啦
我要做一个勇敢的女子,要用自己的力量,立足于这个城市!!!
7楼2013-01-29 19:57:45
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


xpb2005: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-06-19 22:34:24
首先你应该告诉大家,你是怎么样知道这个突变体就是纯合突变体的。如果你是通过PCR的方法的话,你必须知道T-DNA的插入位点,根据插入为点,设计相关的引物。如果T-DNA插入位点位于基因的3“端的时候,全长可能没有了,但是插入位点的5‘端有可能还在表达。当你的定量引物正好设计在插入位点5“端的时候,你当然就可以扩增出来了。这样的情况,我也遇到过。
天道酬勤
8楼2013-06-19 13:43:53
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