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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 拟南芥突变体问题
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xpb2005

银虫 (小有名气)

[求助] 拟南芥突变体问题

我有一个A基因的突变体   鉴定为纯合突变体，   本来我设计了一对这个基因的引物做定量PCR用，  但我用这对引物去扩增这个基因的纯合突变体时（模板为cDNA，提RNA时加了DNAase I 处理），也扩增出了一条目的带，送去测序，结果是这段序列是A基因的一段序列。但我理解突变体是纯合的T-DNA插入突变，应该没有这个基因的mRNA存在的呀，怎么一做反转录后扩增可以扩增出这个基因，不理解？求高手指点？
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1楼 2012-01-09 11:32:53
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xpb2005: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-06-19 22:34:24
首先你应该告诉大家，你是怎么样知道这个突变体就是纯合突变体的。如果你是通过PCR的方法的话，你必须知道T-DNA的插入位点，根据插入为点，设计相关的引物。如果T-DNA插入位点位于基因的3“端的时候，全长可能没有了，但是插入位点的5‘端有可能还在表达。当你的定量引物正好设计在插入位点5“端的时候，你当然就可以扩增出来了。这样的情况，我也遇到过。
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天道酬勤
8楼2013-06-19 13:43:53
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是T-DNA插入突变对这个基因的转录没有影响，把整个插入当作异常蛋白给剪掉了。
我做的毕业论文也是这种情况，实在找不到原因了，师兄就给了我以上的解释。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xpb2005
你的日子如何，你的力量也必如何！
2楼2012-01-11 15:46:23
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xpb2005

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by sxxuan at 2012-01-11 15:46:23:
可能是T-DNA插入突变对这个基因的转录没有影响，把整个插入当作异常蛋白给剪掉了。
我做的毕业论文也是这种情况，实在找不到原因了，师兄就给了我以上的解释。

如果转录不受影响的话，用此基因的全长引物扩增，以突变体的cDNA为模板，没有扩出带，这合理吗？
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3楼2012-01-12 19:27:01
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

T-DNA插入位点如何？是在外显子还是内含子？如果是外显子的话，是靠近启动子的5‘端还是3’端？如果插入靠近3‘端，那么之前的转录可能是不受影响的，如果你设计的引物是根据不受影响的序列来设计的，那当然可以扩出来，但用全长引物，由于下游序列被突变了，所以不能扩增全长。
如果是上述的情况，你订购突变体的时候应该把所以对突变株都买回来，实在不行，也得换个定量PCR的引物，尽量以突变了的序列来设计。
不过我觉得这样其实是选择了对自己有利的数据，并不是这个突变体的所有真实情况的反映，也比较难解释突变体的表型之类的。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
4楼2012-01-13 09:31:34
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