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荧光定量PCR 数据分析及寻找问题 已有1人参与
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本人算半个新手，之前只是做单纯的实验工作，现在需要全程实验+数据整理。但做着做着发现问题越来越多。 现在做的是对核酸的相对定量，引物是上海生工设计和合成，稀释10uM进行实验，并做了两次的预实验（实验流程的掌握和引物的测试），引物测试是稀释样本后进行的荧光定量PCR，cDNA的量做了两个，一个是相当于RNA的50ng，一个是按照试剂盒的最大值100ng进行。流程如下：  对四个mRNA进行测量后，发现其中一个核酸的问题不少，主要是引物测试时发现的 RNA模板量100ng，引物浓度10uM，结果是这样的： [swf]  [/swf]根据要求做了个标准曲线：  惨不忍睹，cq值也在30以上。 因此请教各位同学，到底是哪里出问题了，是核酸本来的含量少，还是引物的浓度太高？ |
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董博士
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-05 21:45:07
yuria: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-12-15 23:01:04
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yuria: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-12-15 23:01:04
| 看峰图，峰值出现的比较晚，都在30个循环以上才出现，一般要求在20个循环左右就出现，这样结果会比较可靠。至于原因的话，在PCR过程中，引物都是过量的，影响应该不会太大，应该是模板量太少了。我们实验室之前做qPCR，都是将1ug的RNA进行20ul体系的反转录，得到的cDNA稀释5倍(稀释到100ul)，取2ul为模板，20ul体系进行qPCR。您可以试试，希望您实验顺利。（反转录试剂盒用的是Promega的。不过现在东洋纺出了一款反转录mix，操作起来比较方便快捷） |
2楼2014-12-05 13:37:58
。3楼2014-12-05 14:35:05
