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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR 数据分析及寻找问题
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yuria

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR 数据分析及寻找问题 已有1人参与

本人算半个新手，之前只是做单纯的实验工作，现在需要全程实验+数据整理。但做着做着发现问题越来越多。
现在做的是对核酸的相对定量，引物是上海生工设计和合成，稀释10uM进行实验，并做了两次的预实验（实验流程的掌握和引物的测试），引物测试是稀释样本后进行的荧光定量PCR，cDNA的量做了两个，一个是相当于RNA的50ng，一个是按照试剂盒的最大值100ng进行。流程如下：
荧光定量PCR 数据分析及寻找问题
对四个mRNA进行测量后，发现其中一个核酸的问题不少，主要是引物测试时发现的
RNA模板量100ng，引物浓度10uM，结果是这样的：
[swf]荧光定量PCR 数据分析及寻找问题-1[/swf]
根据要求做了个标准曲线：
荧光定量PCR 数据分析及寻找问题-2
惨不忍睹，cq值也在30以上。
因此请教各位同学，到底是哪里出问题了，是核酸本来的含量少，还是引物的浓度太高？
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1楼 2014-12-05 11:29:42
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-05 21:45:07
yuria: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-12-15 23:01:04
看峰图，峰值出现的比较晚，都在30个循环以上才出现，一般要求在20个循环左右就出现，这样结果会比较可靠。至于原因的话，在PCR过程中，引物都是过量的，影响应该不会太大，应该是模板量太少了。我们实验室之前做qPCR，都是将1ug的RNA进行20ul体系的反转录，得到的cDNA稀释5倍(稀释到100ul)，取2ul为模板，20ul体系进行qPCR。您可以试试，希望您实验顺利。（反转录试剂盒用的是Promega的。不过现在东洋纺出了一款反转录mix，操作起来比较方便快捷）
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医学&统计学
2楼2014-12-05 13:37:58
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yuria

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 董博士 at 2014-12-05 13:37:58
看峰图，峰值出现的比较晚，都在30个循环以上才出现，一般要求在20个循环左右就出现，这样结果会比较可靠。至于原因的话，在PCR过程中，引物都是过量的，影响应该不会太大，应该是模板量太少了。我们实验室之前做qP ...

首先感谢您的回答。因为是第一次自己负责，而且实验室也没有做荧光定量的经验，遇到问题感觉还是手足无措。
根据您的回答，问题应该就是模板量不够导致的，但有两个问题，一个是之前的实验都是按照试剂盒说明书进行的，若超过100ng这个量，RT反应液超过说明书的建议范围，这样是否意味着可以不按照说明书加？（我隔壁的实验室也是超出范围加的）
另一个是除了这个基因外，我还有其他的基因进行荧光定量，单纯的提高某个基因的模板会不会影响整体实验数据的比较？
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3楼2014-12-05 14:35:05
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