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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 5’RACE有关问题
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静水流燊

新虫 (初入文坛)

[求助] 5’RACE有关问题已有5人参与

最近在做race，我用的是clontech的试剂盒，遇到几个问题，想问问各位大侠，1）我用LA酶P5’端一直没有P出条带来，3’端的有的出来了，也出结果了，5’至今一条也没有出，想不出是我的酶不好，还是我的模板的问题？
2）有的基因我P完了跑胶，发现是从孔里往下一片弥散状，想问这又是什么问题？无论是3’还是5’端都有这样的情况。
我是新手，实验室里也没人做过，希望各位大神能多多帮助我，谢谢！
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1楼2014-12-02 16:35:49
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静水流燊

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-12-02 16:52:23
你肯定用LA省钱啦，特异引物设计还是得讲究下，估计。你这两点没过关

的确是因为省钱才用的，那若是想P出来那用什么酶会比较好，麻烦了
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6楼2014-12-02 19:38:11
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静水流燊

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-12-02 17:43:27
估计你的特异引物设计没弄好，孔里弥散说明没P出来。

我重新设计了，不过我想问怎样才算特异性好，我看那些也都是8、90分的，我都是用primer5.0设计的，还有别的方法么
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7楼2014-12-02 19:40:03
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静水流燊

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 仙缘儒侠 at 2014-12-02 18:57:45
有一团说明特异性不行，重新设计GSP吧，

怎样设计，我都是用primer5.0设计的，感觉都差不多，还有什么讲究么？
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8楼2014-12-02 19:43:54
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静水流燊

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-12-02 20:05:10
primer5.0不怎么地，建议用priner-blast算算
...

是primer-blast么，我用过一次，不过怎么看引物的好坏，以及单个引物设计，好吧，我是新手，完全没有头绪
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10楼2014-12-02 20:38:03
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静水流燊

新虫 (初入文坛)
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13楼: Originally posted by 随风追梦 at 2014-12-06 21:53:35
我也在做这个，不过我觉得还是你的模板或者ＲＴ之前的步骤的问题可能比较大，个人认为Nested PCR前面的步骤很关键，后面的也就和普通ＰＣＲ差不多，所以不认为是你ＬＡ的问题。

你是说我的模板有问题，也对，我5’端的还没有跑出来条带过，不过3’端的到时出来了，是不是RNA降解了？然后你说后面酶用LA就没问题吧 ，谢谢！
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14楼2014-12-08 08:52:16
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