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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 5'RACE总是不出结果，求大神帮助
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修香恋

铜虫 (小有名气)

[求助] 5'RACE总是不出结果，求大神帮助 已有2人参与

本人一直在做5'RACE，但总是没有结果。PCR得到的结果经测序后多次为载体序列，也出现过扩出别的基因的情况，但条带大小看着和预期的差不多。求大神给予指点，不胜感激！
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1楼 2014-03-09 21:54:42
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音四1990

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
修香恋(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-08 12:18:29
你这个说的太笼统了啊…… RACE出不来有很多种可能的 模板RNA质量不好 cDNA反转录失败 引物特异性差 PCR体系不合适 退火温度和延伸时间不恰当 都是有可能的

另外按照我老师说的经验 RACE中出现一些非预计大小的片段很正常 这些片段很有可能是目的基因中的一段 或是其他基因 稍稍研究一下 说不清会有惊喜的
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我没那种命啊轮也不会轮到我
2楼2014-04-08 11:17:52
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修香恋

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-08 11:17:52
你这个说的太笼统了啊…… RACE出不来有很多种可能的 模板RNA质量不好 cDNA反转录失败 引物特异性差 PCR体系不合适 退火温度和延伸时间不恰当 都是有可能的

另外按照我老师说的经验 RACE中出现一些非预计大小的片 ...

谢谢啦!但是我测序之后发现只是通用引物在扩增，找不到自己的特异引物。而且我引物已经设了十条了，都没有结果。请问一下如何判断提取的RNA是否可以用于RACE？
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3楼2014-04-09 11:10:54
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-04-30 13:58:03
RACE中得到假阳性结果是很正常的

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4楼2014-04-09 21:48:10
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音四1990

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 修香恋 at 2014-04-09 11:10:54
谢谢啦!但是我测序之后发现只是通用引物在扩增，找不到自己的特异引物。而且我引物已经设了十条了，都没有结果。请问一下如何判断提取的RNA是否可以用于RACE？...

RNA纯度2.0  浓度比较高 就是挺好的，其实你这个很可能是RNA在反转成cDNA的时候容易失败导致后续扩增没结果 可能你需要的目的基因上存在某种结构 导致产生错配啥的
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我没那种命啊轮也不会轮到我
5楼2014-04-10 21:47:09
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-10 21:47:09
RNA纯度2.0  浓度比较高 就是挺好的，其实你这个很可能是RNA在反转成cDNA的时候容易失败导致后续扩增没结果 可能你需要的目的基因上存在某种结构 导致产生错配啥的...

你用的哪种试剂盒？

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6楼2014-04-11 07:01:02
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音四1990

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-11 07:01:02
你用的哪种试剂盒？
...

诶？好眼熟……
国产的貌似 superswitch 在smart技术上改进的
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7楼2014-04-11 16:34:59
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-11 16:34:59
诶？好眼熟……
国产的貌似 superswitch 在smart技术上改进的...

这种货色我也做得出来哦，不是原创的，所谓改进无非是抄抄得了，我就不用试剂盒，自己做，也挺好

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8楼2014-04-11 20:08:02
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音四1990

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-11 20:08:02
这种货色我也做得出来哦，不是原创的，所谓改进无非是抄抄得了，我就不用试剂盒，自己做，也挺好
...

我很想自己做 试剂盒的引物快用完了 还有一个roche的太贵了不敢下手= =
5‘的Oligo（dG）和3’A尾其实都可以自己做的吧？我看很多大手都是自己合成引物和接头
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我没那种命啊轮也不会轮到我
9楼2014-04-12 09:54:23
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 音四1990 at 2014-04-12 09:54:23
我很想自己做 试剂盒的引物快用完了 还有一个roche的太贵了不敢下手= =
5‘的Oligo（dG）和3’A尾其实都可以自己做的吧？我看很多大手都是自己合成引物和接头...

自己做的话3k应该就差不多了

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10楼2014-04-12 12:22:05
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