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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做了一晚上的5'race，结果这样，该何去何从，求指点
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邂逅星期八

金虫 (正式写手)

[求助] 做了一晚上的5'race，结果这样，该何去何从，求指点 已有5人参与

本次5'race用的是invitrogen的5'race试剂盒，RNA是上午提取的，-80℃保存，晚上做的5’race，巢式PCR第一次得到图一的弥散条带，第二次得到图二，基本看不到条带，是不是失败了呢？可能的原因又有哪些呢？
做了一晚上的5'race，结果这样，该何去何从，求指点
图一.jpg


做了一晚上的5'race，结果这样，该何去何从，求指点-1
图二.jpg
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青春就要在路上
1楼 2014-02-28 15:00:32
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Easony

至尊木虫 (知名作家)

老顽童

【答案】应助回帖

★ ★
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邂逅星期八: 金币+2 2014-03-01 13:14:35
这么不清晰肯定失败了。。。
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自信，坚持，善良，真实，简单生活，敢爱敢恨！
2楼2014-02-28 15:24:12
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邂逅星期八

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Easony at 2014-02-28 15:24:12
这么不清晰肯定失败了。。。

第一次的时候是弥散条带 按说第二次不应该会好些么 失败原因可能有哪些呢
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青春就要在路上
3楼2014-02-28 15:28:34
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
你这试剂盒的原理是什么啊？跟我的有点不一样
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
4楼2014-02-28 16:44:57
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邂逅星期八

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-02-28 16:44:57
你这试剂盒的原理是什么啊？跟我的有点不一样

以mRNA为模板，利用特异性引物GSP1合成cDNA，把mRNA讲解掉，纯化cDNA,然后在cDNA3'端加上CCCC..，在利用自己的特异性引物GSP2 GSP3和它提供的引物进行PCR扩增
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青春就要在路上
5楼2014-02-28 17:00:27
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 邂逅星期八 at 2014-02-28 15:28:34
第一次的时候是弥散条带 按说第二次不应该会好些么 失败原因可能有哪些呢...

我第一次做的只是有非特异性条带，而没有弥散带。。。感觉你这个第一次的就不能用了
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6楼2014-02-28 19:54:18
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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邂逅星期八: 金币+2, ★有帮助 2014-03-01 13:13:39
应该是失败了，估计再重新做一次巢式PCR试试。
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hehe
7楼2014-02-28 19:58:55
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 邂逅星期八 at 2014-02-28 17:00:27
以mRNA为模板，利用特异性引物GSP1合成cDNA，把mRNA讲解掉，纯化cDNA,然后在cDNA3'端加上CCCC..，在利用自己的特异性引物GSP2 GSP3和它提供的引物进行PCR扩增...

不知道你们这个试剂盒的实验案例是否效果很好，我没用过英俊的，根据你说的这个方法貌似是SMART法合成cDNA，我们实验室用过这种方法，也没做出来，后来买了另一种试剂盒，费用很高，不过效果很不错，我做了几次都是成功的，应该用的是Oligo-capping法。
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
8楼2014-02-28 19:59:25
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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邂逅星期八: 金币+3, ★有帮助 2014-03-01 13:14:00
重做巢式PCR
每次的循环加到30
温度梯度试一下

不行还是重新提RNA做吧
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借你一生好不好
9楼2014-02-28 20:27:12
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
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邂逅星期八: 金币+1 2014-03-01 13:14:16
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10楼2014-02-28 20:59:29
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