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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » HRP标记抗体
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maweisimple

铁虫 (小有名气)

[求助] HRP标记抗体 已有4人参与

大家好，最近做HRP标记抗体，参照的是Bioconjugate Techniques,3rd Edition和Thermo的sulfo-SMCC的说明书，可是经过ELISA检测，完全没标上。请问大家有做过这个标记的吗？是什么样的流程呢？哪个步骤是最关键的环节？
拜托拜托~
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Ifyouwantsomething,setitfree.Ifitcomesback,itisyours.Ifitdoesn't,itisnever.
1楼 2014-11-02 21:57:41
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limichuan

金虫 (正式写手)

免疫学实验超人qq：858200882

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★
maweisimple: 金币+1, ★有帮助 2014-12-03 08:17:20
引用回帖:
20楼: Originally posted by maweisimple at 2014-12-02 21:05:47
嗯嗯，我们标记的是羊抗鼠，包被的是小鼠抗体，可是都是我们自己做的，能同时验证活性吗
...

怎么感觉大家都没怎么做过这方面实验似的的呢。抗体制备一般都会测定效价，商业化的鼠单抗一般不会小于十万。标记后的活性是另一回事了，一般在几千到几万不等。现在通用的方法是高碘酸钠法，简单易行，成本低。
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本公司专业从事蛋白纯化，抗体制备等免疫实验技术服务。欢迎咨询qq：858200882
21楼2014-12-02 22:18:26
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普通回帖

ldnh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
maweisimple: 金币+4, ★★★很有帮助, 简洁明了，谢谢！ 2014-11-03 13:38:36
1.HRP分子上缺少能反应的氨基。2.SMCC是一种异型双功能基团，一端和氨基反应，另一端和巯基反应。3.天然IgG上也缺少能反应的自由巯基，要利用DTT或其他一些试剂修饰出能反应的自由巯基。4.一般HRP标记IgG，先用高碘酸钠氧化HRP，产生醛基，醛基能和IgG上富含的氨基生成席弗碱反应，从而达到耦联目的。
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厚德载物，勤劳致富
2楼2014-11-03 10:50:37
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maweisimple

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ldnh at 2014-11-03 10:50:37
1.HRP分子上缺少能反应的氨基。2.SMCC是一种异型双功能基团，一端和氨基反应，另一端和巯基反应。3.天然IgG上也缺少能反应的自由巯基，要利用DTT或其他一些试剂修饰出能反应的自由巯基。4.一般HRP标记IgG，先用高碘 ...

太悲催了，SMCC已经买完了，请问还有挽救的余地吗？
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Ifyouwantsomething,setitfree.Ifitcomesback,itisyours.Ifitdoesn't,itisnever.
3楼2014-11-03 13:39:06
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ldnh

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by maweisimple at 2014-11-03 13:39:06
太悲催了，SMCC已经买完了，请问还有挽救的余地吗？...

SMCC一般不用于抗体耦联HRP，其他酶类可以用这种方法。商品化的HRP标记二抗一般都用高碘酸钠氧化HRP，再耦联IgG.你可以试试这个方法。你是用来标记一抗吗？
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厚德载物，勤劳致富
4楼2014-11-03 14:22:17
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maweisimple

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ldnh at 2014-11-03 14:22:17
SMCC一般不用于抗体耦联HRP，其他酶类可以用这种方法。商品化的HRP标记二抗一般都用高碘酸钠氧化HRP，再耦联IgG.你可以试试这个方法。你是用来标记一抗吗？...

也是标二抗的，HRP和SMCC都定完了，估计要被老板说了
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5楼2014-11-03 16:35:09
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maweisimple

铁虫 (小有名气)
没有人有好办法了吗
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6楼2014-11-11 11:43:13
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可儿不苦

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-11-19 11:29:43
我用的改良过碘酸钠法，标的单抗，效价1:2000还不错。注意酶和抗体的用量1:2，然后注意你的酶和抗体的pH，反应注意避光震荡。至于protocol，简易过碘酸钠法，百度很多。希望对你有帮助。
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幸福那一个美梦，是二人同行才有。
7楼2014-11-18 19:11:58
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maweisimple

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 可儿不苦 at 2014-11-18 19:11:58
我用的改良过碘酸钠法，标的单抗，效价1:2000还不错。注意酶和抗体的用量1:2，然后注意你的酶和抗体的pH，反应注意避光震荡。至于protocol，简易过碘酸钠法，百度很多。希望对你有帮助。

谢谢~
可是2000倍的效价是不是有些低呢？我们购买进口的标记物效价一万以上。
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Ifyouwantsomething,setitfree.Ifitcomesback,itisyours.Ifitdoesn't,itisnever.
8楼2014-11-19 13:42:52
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可儿不苦

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
maweisimple: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2014-11-20 12:20:28
引用回帖:
8楼: Originally posted by maweisimple at 2014-11-19 13:42:52
谢谢~
可是2000倍的效价是不是有些低呢？我们购买进口的标记物效价一万以上。...

哦，那我就不清楚了，反正我们实验室都是自己标的，这个效价老师说效果挺好的了，我每次只用几微升。对了，还要注意纯化时饱和硫酸铵要边搅拌逐滴加入，防止部分浓度过高产生变性蛋白沉淀。
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幸福那一个美梦，是二人同行才有。
9楼2014-11-19 15:43:12
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sfeqhl

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
maweisimple: 金币+1, ★有帮助 2014-12-02 15:45:03
我们用的高碘酸钠法，效价在1:5000到1:10000之间，当然你的抗体得好

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10楼2014-11-19 17:43:44
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