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guobingyuan

铁杆木虫 (小有名气)

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[求助] 7M urea变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测单链DNA，银染显色求助已有1人参与

现在用7M尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测碱基数40—50左右的单链DNA，最后用银染法显色，具体过程是先用10%醋酸固定，之后用0.1%硝酸银染色，最后用氢氧化钠甲醛溶液还原。问题是胶的背景很深，在凝胶成像仪上看不清，我又将硝酸银含量降低，染色时间降低，染色后洗涤时间延长，降低还原液浓度，通过延长还原时间使得背景浅且条带深。但几次试验之后发现还原时间延长还会导致背景很深，此外，条带也不明显，为粉红色。之前是粉红色夹杂亮白色，怀疑是上样量过大，现在降低了上样量，大概每个孔的上样量在几纳克至十几纳克，但依然是条带不明显（粉红色或淡淡的粉红色），并且背景也会由于还原时间延长而变得很深。希望大家给我支支招，谢谢了！

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黎明之前天最黑

1楼 2014-10-22 21:56:15

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guobingyuan

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 永远一片天 at 2014-11-17 18:33:31
最近也需要跑DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳，想问下楼主，DNA聚丙烯酰胺凝胶一般不都是跑蛋白的吗？跑DNA灵敏度真的比琼脂糖的高吗？那DNA聚丙烯酰胺凝胶的设备与蛋白质聚丙烯酰胺的设备是一样的吗？目前实验室没有这套设备 ...

琼脂糖是分离较长链段的DNA，对于较短的DNA应该用PAGE。琼脂糖用的是水平电泳槽，PAGE用的是垂直电泳槽，所以就是用的跑蛋白的电泳槽。要根据你的链段长度选择胶的浓度。可以查看《分子克隆实验指南》