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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 7M urea变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测单链DNA，银染显色求助
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guobingyuan

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 7M urea变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测单链DNA，银染显色求助 已有1人参与

现在用7M尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测碱基数40—50左右的单链DNA，最后用银染法显色，具体过程是先用10%醋酸固定，之后用0.1%硝酸银染色，最后用氢氧化钠甲醛溶液还原。问题是胶的背景很深，在凝胶成像仪上看不清，我又将硝酸银含量降低，染色时间降低，染色后洗涤时间延长，降低还原液浓度，通过延长还原时间使得背景浅且条带深。但几次试验之后发现还原时间延长还会导致背景很深，此外，条带也不明显，为粉红色。之前是粉红色夹杂亮白色，怀疑是上样量过大，现在降低了上样量，大概每个孔的上样量在几纳克至十几纳克，但依然是条带不明显（粉红色或淡淡的粉红色），并且背景也会由于还原时间延长而变得很深。希望大家给我支支招，谢谢了！

7M urea变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测单链DNA，银染显色求助
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7M urea变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测单链DNA，银染显色求助-1
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黎明之前天最黑
1楼 2014-10-22 21:56:15
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aoda123

木虫 (正式写手)
最近我也要做变性PAGE胶来分离单链DNA，以前没有接触过，请教你几个问题，跑胶缓冲液需要TBE是吗，Marker要怎么选择呢,还有loading buffer怎么配呢
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身体健康，工作顺利
2楼2014-10-24 15:38:12
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永远一片天

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

最近也需要跑DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳，想问下楼主，DNA聚丙烯酰胺凝胶一般不都是跑蛋白的吗？跑DNA灵敏度真的比琼脂糖的高吗？那DNA聚丙烯酰胺凝胶的设备与蛋白质聚丙烯酰胺的设备是一样的吗？目前实验室没有这套设备，可以借用隔壁跑蛋白的吗？
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3楼2014-11-17 18:33:31
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guobingyuan

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aoda123 at 2014-10-24 15:38:12
最近我也要做变性PAGE胶来分离单链DNA，以前没有接触过，请教你几个问题，跑胶缓冲液需要TBE是吗，Marker要怎么选择呢,还有loading buffer怎么配呢

缓冲液是1×TBE，可以先配10×，用时稀释。marker应该用单链，但是RNA  marker极易降解，我用的是自己买来的不同长度ssDNA片段混合作为marker。loading buffer我是用的2:1体积比的原液和甘油混合，买来的原液是6×，但怕样品沉不下去所以甘油加的多一些。
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黎明之前天最黑
4楼2014-11-18 15:50:16
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guobingyuan

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 永远一片天 at 2014-11-17 18:33:31
最近也需要跑DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳，想问下楼主，DNA聚丙烯酰胺凝胶一般不都是跑蛋白的吗？跑DNA灵敏度真的比琼脂糖的高吗？那DNA聚丙烯酰胺凝胶的设备与蛋白质聚丙烯酰胺的设备是一样的吗？目前实验室没有这套设备 ...

琼脂糖是分离较长链段的DNA，对于较短的DNA应该用PAGE。琼脂糖用的是水平电泳槽，PAGE用的是垂直电泳槽，所以就是用的跑蛋白的电泳槽。要根据你的链段长度选择胶的浓度。可以查看《分子克隆实验指南》
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黎明之前天最黑
5楼2014-11-18 15:53:08
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