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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 病毒全基因组测序问题。。求大牛~~~
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福建生猪

新虫 (初入文坛)

[求助] 病毒全基因组测序问题。。求大牛~~~已有4人参与

本人想对某一病毒进行基因组测序，已经过细胞培养分离病毒并鉴定，现在准备送测序。问题：
1.怎么把病毒的DNA从细胞培养液提取出来，采用常规的DNA提取试剂盒？
2.采用常规的dna提取试剂盒，这样的话是不是也把宿主（培养用的细胞）的DNA也提取出来，有什么方法可以减低宿主的污染？
3.提取出来的dna怎么鉴定纯度，以达高通量测序要求。
万分感谢！！！！
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1楼2014-10-20 20:59:25
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福建生猪

新虫 (初入文坛)
大牛大牛。。。
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2楼2014-10-22 08:26:49
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-22 12:24:25
福建生猪: 金币+8, ★★★很有帮助 2014-10-23 11:01:10
DNA病毒还是RNA病毒？
根据病毒选择试剂盒，现在市场上用于NGS的病毒提取核酸试剂盒有不少，比如QIAGEN RNeasy Plus
这个可以降低来源于宿主或者样本中背景DNA信息，就是去除 gDNA。
另外还要注意去除核酸提取物中的 rRNA 序列。
纯度鉴定最常见就是运行Agilent Bioanalyzer 2100
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3楼2014-10-22 11:20:44
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
福建生猪: 金币+1 2014-10-23 11:01:19
TIANGEN有提取病毒DNA的试剂盒。
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4楼2014-10-23 08:52:30
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664183455

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
推荐Invitrogen的PURELINK VIRAL RNA/DNA KIT提取病毒DNA，
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5楼2014-10-23 10:16:11
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福建生猪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 664183455 at 2014-10-23 10:16:11
推荐Invitrogen的PURELINK VIRAL RNA/DNA KIT提取病毒DNA，

楼主有用过吗？效果怎么样？
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6楼2014-10-23 11:02:19
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福建生猪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by soarrow at 2014-10-22 11:20:44
DNA病毒还是RNA病毒？
根据病毒选择试剂盒，现在市场上用于NGS的病毒提取核酸试剂盒有不少，比如QIAGEN RNeasy Plus
这个可以降低来源于宿主或者样本中背景DNA信息，就是去除 gDNA。
另外还要注意去除核酸提取物 ...

DNA病毒，本实验室只有nanodrop2000，能凑合着吗？还有QIAGEN的试剂盒您使用过吗？效果怎么样？
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7楼2014-10-23 11:06:01
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★ ★
福建生猪(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-24 21:07:11
引用回帖:
7楼: Originally posted by 福建生猪 at 2014-10-23 11:06:01
DNA病毒，本实验室只有nanodrop2000，能凑合着吗？还有QIAGEN的试剂盒您使用过吗？效果怎么样？...

Nanodrop和Qubit这类只能测定浓度，不能鉴定纯度以及核酸大小的分布。所以最好是使用Bioanalyzer 2100和High sensitivity DNA Kit来进行芯片电泳分析。如果实在没有这个仪器，你还可以用测量浓度和毛细管电泳仪，比如QIAxel这里仪器--可以看看提取核酸的大小以及浓度分布状况。

我们做的主要RNA病毒，所以使用QIAGEN RNeasy Plus这个试剂盒，里面带了一个可以去除宿主 gDNA 的柱子。这个试剂盒我们已经用了2年，陆陆续续做了几十张片子吧，效果还行。

DNA病毒的话，可以使用5楼提到的，这个是简介
The PureLink® Viral RNA/DNA Mini Kit provides a rapid and efficient method to simultaneously purify viral RNA/DNA from fresh or frozen cell-free biological fluids (plasma, serum, cerebrospinal fluid) and cell culture supernatants.
链接：http://www.lifetechnologies.com/ ... ICID=search-product
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8楼2014-10-23 13:14:52
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福建生猪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by soarrow at 2014-10-23 13:14:52
Nanodrop和Qubit这类只能测定浓度，不能鉴定纯度以及核酸大小的分布。所以最好是使用Bioanalyzer 2100和High sensitivity DNA Kit来进行芯片电泳分析。如果实在没有这个仪器，你还可以用测量浓度和毛细管电泳仪，比 ...

楼主，再请教你一个问题。使用Bioanalyzer 2100分析，是不是看下相应的DNA大小的峰值，然后对DNA分布进行评估。还有有没有Bioanalyzer 2100使用说明书，具体的操作。谢谢~~~
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9楼2014-10-29 10:24:39
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 福建生猪 at 2014-10-29 10:24:39
楼主，再请教你一个问题。使用Bioanalyzer 2100分析，是不是看下相应的DNA大小的峰值，然后对DNA分布进行评估。还有有没有Bioanalyzer 2100使用说明书，具体的操作。谢谢~~~...

那就把俺的说明书给共享一下吧。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=8085514
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10楼2014-10-29 12:55:46
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