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疯狂的麦子

无虫 (小有名气)

[求助] 小白求助基因克隆步骤 已有2人参与

如果已知一个物种的某段基因的序列，怎样利用生物信息学方法，克隆到与该物种同源的另一个物种的具有相同功能的基因。具体步骤该怎么做，我blast了一下，就找到一个目的物种与其同源的基因序列，接下来该怎么设计引物呢，用到哪些软件麻烦都告诉我一下，不要求具体操作，但是希望能告知大体流程。如果顺利多长时间可以拿到该基因，功能验证的话应该怎么验证，要花多长时间大概，也希望告知。功能验证能不能利用northern blot验证呢，该基因是与根尖分裂有关的，想着看一下干旱胁迫后该基因的表达情况能行么。
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1楼 2014-10-12 23:25:42
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疯狂的麦子

无虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by nwsuafliu at 2014-10-13 11:29:11
这个好办。你有了水稻的序列，那么通过blastn，就可以得到大麦中的同源基因的序列。你可以去大麦基因组数据库进行blast。

得到大麦基因序列以后，根据其序列来设计引物，用大麦的DNA作为模板进行扩增。

如果 ...

实时荧光定量分析，能说明问题么，前面听人说好像这种方法目前认可度不高了呢？要做northern blot的话是不是必须要克隆到基因才可以做呢？我是完全不懂分子这块，本来试验里没想要做的，但是现在分子又是热点，迫不得已。
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5楼2014-10-13 11:50:10
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nwsuafliu

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-13 09:05:53
疯狂的麦子: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-10-13 11:25:44
简单的流程如下，你既然已经知道这个基因的序列，那么如下操作便可。
1 设计引物。可以使用软件primer6, oligo6.或者使用Primer3在线设计工具。我个人习惯使用primer3的在线设计
2 PCR扩增 - 胶回收 、纯化 - 连接反应 - 转化大肠杆菌（DH5a) - 提取质粒 - 测序验证序列正确性。
3 表达载体构建。把步骤2得到的基因片段转入植物表达载体，例如pCAMBIA1301.
4 植物遗传转化。农杆菌介导得到转基因苗。
5 查看表型。

如果只是看胁迫条件下的表达，那么直接根据cDNA序列设计引物，采集对照条件和胁迫条件下的根、叶样品，提取RNA，进行RT-PCR即可，可半定量或者定量。
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知识改变命运
2楼2014-10-13 08:48:17
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疯狂的麦子

无虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by nwsuafliu at 2014-10-13 08:48:17
简单的流程如下，你既然已经知道这个基因的序列，那么如下操作便可。
1 设计引物。可以使用软件primer6, oligo6.或者使用Primer3在线设计工具。我个人习惯使用primer3的在线设计
2 PCR扩增 - 胶回收 、纯化 - 连接 ...

已知的序列是水稻的一段序列，但是我想要得到与水稻同源的大麦的具有相同功能的基因序列，能不能根据水稻的序列设计引物，然后用大麦的DNA做模板，进行PCR呢？我其实只是想看下胁迫条件下该基因在大麦中的表达，看看与干旱有没有关系，你最后面说的用cDNA设计引物，能用水稻来设计大麦的么?听说只做实时荧光定量不太能说明问题啊，有这回事么？
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3楼2014-10-13 10:12:12
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nwsuafliu

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
疯狂的麦子(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:51:26
引用回帖:
3楼: Originally posted by 疯狂的麦子 at 2014-10-13 10:12:12
已知的序列是水稻的一段序列，但是我想要得到与水稻同源的大麦的具有相同功能的基因序列，能不能根据水稻的序列设计引物，然后用大麦的DNA做模板，进行PCR呢？我其实只是想看下胁迫条件下该基因在大麦中的表达，看 ...

这个好办。你有了水稻的序列，那么通过blastn，就可以得到大麦中的同源基因的序列。你可以去大麦基因组数据库进行blast。

得到大麦基因序列以后，根据其序列来设计引物，用大麦的DNA作为模板进行扩增。

如果你只是看这个基因是否响应干旱胁迫，就不需要克隆它了。只需要根据该基因的cDNA序列设计引物，进行RT-PCR。
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知识改变命运
4楼2014-10-13 11:29:11
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