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疯狂的麦子

无虫 (小有名气)

[求助] 小白求助基因克隆步骤 已有2人参与

如果已知一个物种的某段基因的序列，怎样利用生物信息学方法，克隆到与该物种同源的另一个物种的具有相同功能的基因。具体步骤该怎么做，我blast了一下，就找到一个目的物种与其同源的基因序列，接下来该怎么设计引物呢，用到哪些软件麻烦都告诉我一下，不要求具体操作，但是希望能告知大体流程。如果顺利多长时间可以拿到该基因，功能验证的话应该怎么验证，要花多长时间大概，也希望告知。功能验证能不能利用northern blot验证呢，该基因是与根尖分裂有关的，想着看一下干旱胁迫后该基因的表达情况能行么。
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1楼 2014-10-12 23:25:42
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nwsuafliu

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 鼓励交流 2014-10-13 09:05:53
疯狂的麦子: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-10-13 11:25:44
简单的流程如下，你既然已经知道这个基因的序列，那么如下操作便可。
1 设计引物。可以使用软件primer6, oligo6.或者使用Primer3在线设计工具。我个人习惯使用primer3的在线设计
2 PCR扩增 - 胶回收 、纯化 - 连接反应 - 转化大肠杆菌（DH5a) - 提取质粒 - 测序验证序列正确性。
3 表达载体构建。把步骤2得到的基因片段转入植物表达载体，例如pCAMBIA1301.
4 植物遗传转化。农杆菌介导得到转基因苗。
5 查看表型。

如果只是看胁迫条件下的表达，那么直接根据cDNA序列设计引物，采集对照条件和胁迫条件下的根、叶样品，提取RNA，进行RT-PCR即可，可半定量或者定量。
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知识改变命运
2楼2014-10-13 08:48:17
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疯狂的麦子

无虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by nwsuafliu at 2014-10-13 08:48:17
简单的流程如下，你既然已经知道这个基因的序列，那么如下操作便可。
1 设计引物。可以使用软件primer6, oligo6.或者使用Primer3在线设计工具。我个人习惯使用primer3的在线设计
2 PCR扩增 - 胶回收 、纯化 - 连接 ...

已知的序列是水稻的一段序列，但是我想要得到与水稻同源的大麦的具有相同功能的基因序列，能不能根据水稻的序列设计引物，然后用大麦的DNA做模板，进行PCR呢？我其实只是想看下胁迫条件下该基因在大麦中的表达，看看与干旱有没有关系，你最后面说的用cDNA设计引物，能用水稻来设计大麦的么?听说只做实时荧光定量不太能说明问题啊，有这回事么？
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3楼2014-10-13 10:12:12
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nwsuafliu

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
疯狂的麦子(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:51:26
引用回帖:
3楼: Originally posted by 疯狂的麦子 at 2014-10-13 10:12:12
已知的序列是水稻的一段序列，但是我想要得到与水稻同源的大麦的具有相同功能的基因序列，能不能根据水稻的序列设计引物，然后用大麦的DNA做模板，进行PCR呢？我其实只是想看下胁迫条件下该基因在大麦中的表达，看 ...

这个好办。你有了水稻的序列，那么通过blastn，就可以得到大麦中的同源基因的序列。你可以去大麦基因组数据库进行blast。

得到大麦基因序列以后，根据其序列来设计引物，用大麦的DNA作为模板进行扩增。

如果你只是看这个基因是否响应干旱胁迫，就不需要克隆它了。只需要根据该基因的cDNA序列设计引物，进行RT-PCR。
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知识改变命运
4楼2014-10-13 11:29:11
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疯狂的麦子

无虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by nwsuafliu at 2014-10-13 11:29:11
这个好办。你有了水稻的序列，那么通过blastn，就可以得到大麦中的同源基因的序列。你可以去大麦基因组数据库进行blast。

得到大麦基因序列以后，根据其序列来设计引物，用大麦的DNA作为模板进行扩增。

如果 ...

实时荧光定量分析，能说明问题么，前面听人说好像这种方法目前认可度不高了呢？要做northern blot的话是不是必须要克隆到基因才可以做呢？我是完全不懂分子这块，本来试验里没想要做的，但是现在分子又是热点，迫不得已。
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5楼2014-10-13 11:50:10
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
疯狂的麦子(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:51:40
荧光定量认可度很高吧
做Nothern blot  不用克隆到基因，也是RT。
具体看看实验操作流程就知道了
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6楼2014-10-13 16:12:50
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nwsuafliu

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
疯狂的麦子: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-10-14 20:38:57
引用回帖:
5楼: Originally posted by 疯狂的麦子 at 2014-10-13 11:50:10
实时荧光定量分析，能说明问题么，前面听人说好像这种方法目前认可度不高了呢？要做northern blot的话是不是必须要克隆到基因才可以做呢？我是完全不懂分子这块，本来试验里没想要做的，但是现在分子又是热点，迫不 ...

实时荧光定量分析完全说明问题。认可度也很高。不用担心。
如果你要做northern blot也可以，PCR扩增cDNA的一段作为探针就行，不需要克隆基因全长。
另外，鉴于您对分子生物学没有概念，建议你读几篇简单的文献。中文的文献即可。
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知识改变命运
7楼2014-10-14 09:47:57
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疯狂的麦子

无虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by nwsuafliu at 2014-10-14 09:47:57
实时荧光定量分析完全说明问题。认可度也很高。不用担心。
如果你要做northern blot也可以，PCR扩增cDNA的一段作为探针就行，不需要克隆基因全长。
另外，鉴于您对分子生物学没有概念，建议你读几篇简单的文献。 ...

我还有一个问题不太懂现在，我利用实时荧光定量测定的是不同干旱时间处理后的该基因的表达量，该基因可能对根尖细胞分生组织的细胞分裂有关，突变体会影响初生根和不定根的伸长，这是别人在水稻上验证了的，我想在大麦中看看该基因的表达量与幼苗根系形态建成的影响或者是两者之间的关系。这样的逻辑通么？就是说基因表达量能不能够说明形态上出现的差异呢，根系形态我想从根长，根表面积，根尖数量以及各种显微结构来说明，有没有说服力呢？昨天有人跟我说要找到该基因控制的蛋白，从蛋白上说明问题，有没有这个必要呢，我只是想初步看看两者之间的影响，做一下。逻辑上说的通么？望解答，实在不好意思。
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8楼2014-10-15 17:43:53
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nwsuafliu

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 疯狂的麦子 at 2014-10-15 17:43:53
我还有一个问题不太懂现在，我利用实时荧光定量测定的是不同干旱时间处理后的该基因的表达量，该基因可能对根尖细胞分生组织的细胞分裂有关，突变体会影响初生根和不定根的伸长，这是别人在水稻上验证了的，我想在 ...

你去看二者之间的correlation当然是可以的。问题是，在时间尺度上，说服力并不强。举个例子，干旱处理后，这个基因的表达可能几个小时就发生了改变，而根形态差异你未必在几个小时就能看到。

查看蛋白的变化，和查看基因表达，作用类似。当然，如果能证明蛋白水平的变化，更能说明这个基因involved in drought response.
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知识改变命运
9楼2014-10-15 23:05:29
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伯信生物-Sam

新虫 (初入文坛)
内容已删除
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10楼2015-06-25 22:16:54
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