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小白求助基因克隆步骤 已有2人参与
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| 如果已知一个物种的某段基因的序列，怎样利用生物信息学方法，克隆到与该物种同源的另一个物种的具有相同功能的基因。具体步骤该怎么做，我blast了一下，就找到一个目的物种与其同源的基因序列，接下来该怎么设计引物呢，用到哪些软件麻烦都告诉我一下，不要求具体操作，但是希望能告知大体流程。如果顺利多长时间可以拿到该基因，功能验证的话应该怎么验证，要花多长时间大概，也希望告知。功能验证能不能利用northern blot验证呢，该基因是与根尖分裂有关的，想着看一下干旱胁迫后该基因的表达情况能行么。 |
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nwsuafliu
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nwsuafliu
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【答案】应助回帖
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简单的流程如下，你既然已经知道这个基因的序列，那么如下操作便可。 1 设计引物。可以使用软件primer6, oligo6.或者使用Primer3在线设计工具。我个人习惯使用primer3的在线设计 2 PCR扩增 - 胶回收 、纯化 - 连接反应 - 转化大肠杆菌（DH5a) - 提取质粒 - 测序验证序列正确性。 3 表达载体构建。把步骤2得到的基因片段转入植物表达载体，例如pCAMBIA1301. 4 植物遗传转化。农杆菌介导得到转基因苗。 5 查看表型。 如果只是看胁迫条件下的表达，那么直接根据cDNA序列设计引物，采集对照条件和胁迫条件下的根、叶样品，提取RNA，进行RT-PCR即可，可半定量或者定量。 |
2楼2014-10-13 08:48:17
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nwsuafliu
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