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就会提核酸

铜虫 (初入文坛)

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专业: 蛋白质组学

[交流] 使用 TRIzol 方法抽提 RNA 的调整做法已有7人参与

这是一家国外公司的简单操作步骤，中文是我当年使用类似产品时的调整做法。

1. Homogenize tissue samples in 10–20 volumes TRI Reagent solution. Homogenize cultured cells in 1 mL TRI Reagent solution per 5–10 x 106 cells, or per 10 cm2 culture dish area.
无论什么组织，1 ml TRI Reagent 裂解不超过 50 mg 样品，结果更加可靠。
样品保存液保存的样品，首先不超过 50 mg，其次，一定要用吸水纸将保存液彻底吸干。
2. Incubate the homogenate for 5 min at room temp.
如果温度比较低，延长至 10 分钟。样品保存液保存的样品，以及肌肉组织或者其它难裂解的样品，再延长 5 分钟。这一步操作的好坏，决定了蛋白质残留的多寡。
3. (Optional) Centrifuge at 12,000 xg for 10 min at 4°C and transfer the supernatant to a fresh tube.
难裂解的样品，以及杂质含量高的样品，都采用此步操作。当然，可以离心 3 分钟替代，以缩短时间。
4. Add 200 μL chloroform per 1 mL of TRI Reagent solution, mix well, and incubate at room temp for 5–15 min.
混匀一定要用手剧烈晃动的方法，至达到均匀的乳状体系为止。振荡器的效果不好。
静置时间的掌控方法：体系彻底分层，不再发生变化即可进行下一步操作。如果发现有样品分层明显不好，再次混匀并使之彻底分层。
5. Centrifuge at 12,000 x g for 10–15 min at 4°C, then transfer the aqueous phase to a fresh tube.
离心速度越高越好。
如果没有 4C 离心机，可以采用变通的办法：样品冰浴 5 分钟后离心 5 分钟，取出再冰浴 5 分钟后再次离心 5 分钟。操作要动作小一些，尽可能不惊动体系。
取上清使用 200 ul 移液器，一般最多移取 2 次共 400 ul；吸液速度一定要慢而均匀，减少对中间层的惊动。不要使用 1 ml 移液器。
为什么要 4C 离心？是为了降低 DNA 在上清中的残留。为什么 4C 能降低 DNA 残留？因为温度低，则苯酚/氯仿在上清的溶解度也就随之降低，其中的 DNA 自然就少了。
6. Add 500 μL of isopropanol per 1 mL of TRI Reagent solution, vortex for 5–10 sec, and incubate at room temp for 5–10 min.
异丙醇的用量与获得的上清等体积。
是否温浴以及温浴时间的掌控标准：与异丙醇混匀后，如果体系清亮度发生明显变化 (可以在一个离心管中加入 50% 异丙醇作为参照)，就可以离心了，哪怕是刚刚混匀；如果预期得率比较低，则静置 10 分钟。
7. Centrifuge at 12,000 x g for 8 min at 4–25°C, and discard the supernatant.
得率高的样品，只离心 3 分钟。杂质高的样品，离心速度经常使用 7,500 x g。如果离心后看不见沉淀，则颠倒离心管数次以混匀后，置于 4C 冰箱 30 分钟，再次离心。
8. Add 1 mL of 75% ethanol per 1 mL of TRI Reagent solution.
9. Centrifuge at 7,500 x g for 5 min, remove the ethanol, and briefly air dry the RNA pellet.
步骤 2 决定蛋白质残留，洗涤手法决定盐残留和多糖残留，非常重要。
将 75% 乙醇倒入带滴管的瓶中，置于右手边，左手边放离心管架。取一个样品，开盖后小心倒掉上清，立即滴入 75% 乙醇，再小心倒掉 (眼睛紧盯沉淀处)，再滴入 75% 乙醇。如果沉淀时使用的是等体积异丙醇，则盖上盖子，颠倒混匀数次后，放回离心管架；如果沉淀使用的是 50% 异丙醇 + 50% 高盐沉淀试剂，则将第二次的 75% 乙醇同样倒掉，再第三次加入 75% 乙醇，盖上盖子，颠倒混匀数次后，放回离心管架。同样处理其它的样品。全部处理完后，再次颠倒全部离心管混匀，并依次小心倒掉上清。将离心管移入离心机，高速离心 1 分钟，用 50-100ul 移液器将残液彻底吸出。开盖自然干燥 2 分钟。
对多糖含量高的样品，加入 75% 乙醇后，残留上清中的多糖会立即变成絮状沉淀，如果不去掉这些沉淀就离心，则多糖残留会非常严重。RNA 沉淀是相当紧实的，一般性的混匀都不会打散它；加之加入 75% 乙醇后也比较容易观察到，这才为不离心而去除多糖的洗涤方式提供了保障。如果沉淀看不见，就不建议用这个方法了。
RNA 沉淀不贴壁并不影响倾倒操作。要点是：待沉淀沉底后，再开盖慢慢倒。
10.Dissolve RNA in the buffer of your choice.

The A260/A280 ratio of the RNA is an indication of its purity. The total RNA isolated with this procedure should have an A260/A280 ratio of 1.8–2.2.

小结
TRI Reagent (包括 TRIzol 等类似试剂) 抽提的 RNA，基因组 DNA 残留为电泳隐约可见 (曝光足够的话)，OD 检测的常态为：A260/A280 > 1.8，A260/A230 < 1.8。试图进一步降低基因组 DNA 残留是徒劳的 (DNA 残留量约为 1% RNA 的量)，因为 TRI Reagent 的方法，其最大的优点，是其获得的 RNA，蛋白质残留非常低。盐的残留虽然可能导致 A260/A230 < 1.0，却几乎不影响与 RT 相关的后续实验。如果发现 A260/A280 < 1.5，建议一定要同时测一下 A260/A230：如果该比值也低，这个样品更可能能满足后续实验的要求；如果该比值不低，才提示是蛋白质的残留。
TRI Reagent 方法抽提的 RNA 的电泳带型 (非变性电泳) 并不一致。比方说，每步静置操作都置于冰上与都置于室温所获得的 RNA 的带型可以不同，裂解后立即抽提和裂解后置于冰箱第二天抽提，RNA 带型也可以不通。所以，千万不要拘泥于所谓 2:1 的带型。

Proteoglycan and polysaccharide contamination
The following modification of steps 6 and 7 effectively precipitates RNA while leaving polysaccharides and proteoglycans in the supernatant.
a. Transfer the aqueous phase from step 5 to a fresh tube. For each 1 mL of TRI Reagent solution used for the homogenization, add 250 μL of isopropanol and 250 μL of a high salt precipitation solution (e.g. 0.8 M sodium citrate and 1.2 M NaCl).
b. Mix well, store for 5–10 min at room temperature, and centrifuge at 12,000 x g for 8 min at 4–25°C.
c. Wash the resulting RNA pellet as described in steps 8 and 9 of the procedure.
When isolating RNA from plant material containing a very high level of polysaccharides, include the optional centrifugation described in step 3 and use the modified RNA precipitation described above.

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