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1楼2014-09-30 01:05:24

langzian

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箭头是向两个方向画的，表明P T并不配对，翻译时从ATG起始，数好就没有问题的

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江山

2楼2014-09-30 03:44:35

jurkat.1640

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如果His tag在前面，那么后面无论怎么连接都不能改变His tag的表达（如果移码就没有His tag）

3楼2014-09-30 11:05:24

jian212

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通常引物设计是酶切位点+His tag（如果纯化）+目的基因

GPD Promoters 是启动子。之后从ATG 开始翻译，你只需要在你的 His tag（如果纯化）之前加上起始密码子就没有什么问题了。
Forword prime 位点应该是XbaI

学习再学习，努力再努力。

4楼2014-09-30 11:17:47

gyesang

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1. Histag前还多出来一些序列,His tag前面还有ATG么，如果没有，多几个碱基没有关系

2. 不是顺时针就是forward，promoter的方向才是forward，你顺着promoter的方向就可以

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5楼2014-09-30 15:31:49

xulinan

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2楼: Originally posted by langzian at 2014-09-30 03:44:35
箭头是向两个方向画的，表明P T并不配对，翻译时从ATG起始，数好就没有问题的

你好，没有很明白你的意思，PT不配对是什么意思？翻译从ATG起始是说不论promoter和ATG之间有几个碱基，翻译的时候都会从ATG开始吗？比如ATG前面多了两个成了CCATG，那么翻译的时候还是会直接识别ATG而不会导致CCA这种错误出现对吧。但是如果前边存在一个ATG+his6+CCATG，那么第二个ATG就肯定是变成了CCA翻译出来的，这样理解是否正确？谢谢

6楼2014-09-30 17:44:35

xulinan

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4楼: Originally posted by jian212 at 2014-09-30 11:17:47
通常引物设计是酶切位点+His tag（如果纯化）+目的基因

GPD Promoters 是启动子。之后从ATG 开始翻译，你只需要在你的 His tag（如果纯化）之前加上起始密码子就没有什么问题了。
Forword prime 位点应该是X ...

我是觉得如果用XbaI/EcoRI这对酶切位点的时候应该是XbaI在forward primer里，不过查了下别的用法，竟然是EcoRI在forward primer里，然后我就混乱了

7楼2014-09-30 17:54:01

xulinan

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5楼: Originally posted by gyesang at 2014-09-30 15:31:49
1. Histag前还多出来一些序列,His tag前面还有ATG么，如果没有，多几个碱基没有关系

2. 不是顺时针就是forward，promoter的方向才是forward，你顺着promoter的方向就可以

非常感谢你的回复，还是有些问题：
1. 我的Hsi tag前面是有ATG的，应该是his tag前多几个碱基没关系吧？按你的说法，his6前有ATG的话，前面多几个碱基是有影响的？混乱了....
2. Forward primer中包含的酶切位点应该是靠近promoter的，比如用XbaI/EcoRI这对酶切位点的时候应该是XbaI在forward primer里，但是有人用XbaI/EcoRI这对酶切位点的时候EcoRI在forward primer里，这样连接不就反了吗？还是我理解错误了

8楼2014-09-30 18:08:24

gyesang

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xulinan: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2014-09-30 19:08:19

引用回帖:

8楼: Originally posted by xulinan at 2014-09-30 18:08:24
非常感谢你的回复，还是有些问题：
1. 我的Hsi tag前面是有ATG的，应该是his tag前多几个碱基没关系吧？按你的说法，his6前有ATG的话，前面多几个碱基是有影响的？混乱了....
2. Forward primer中包含的酶切位点 ...

1. 如果ATG-His-Tag前面没有没有其他ATG了，比如CCATG-His-Tag这种，怎么可能会出现CCA这种错误呢，翻译一定是从起始密码子开始，建议你多看看生化书

2. 不必纠结于Forward 还是reverse，子要你将你的序列顺着启动子的方向克隆在其下游就可以了

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9楼2014-09-30 18:39:42

kehan777

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xulinan: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢回复 2014-10-04 18:18:44

可能是kozak序列gccgccacc,老板弄少了一段但也能增强表达，阅读框应为acc+ATG+his tag+目的基因, 然后第一个a被弄丢了其实也没关系，his tag后面是直接+目的基因，所以保证ATG开始阅读正确就行

10楼2014-10-04 00:55:45