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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒图谱与阅读框问题
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xulinan

木虫 (小有名气)

[求助] 质粒图谱与阅读框问题 已有1人参与

有两个问题请教下。
1. 我们克隆基因到一个质粒上的时候，通常引物设计是酶切位点+His tag（如果纯化）+目的基因，  但是现在的问题是老师给了一个很奇怪的序列，His tag和目的基因都有，但是Histag前还多出来一些序列，并且这些碱基不是3的整数倍，他让我用不同的酶切位点克隆到另一个质粒上，我就想如果直接按他的要求直接克隆这个序列是不是翻译的时候就框移了，因为明显的His tag前面多的几个碱基不是3的倍数啊，困惑中，又不好意思直接去找老师说他给的序列不对。请问这种情况是否会发生翻译时候框移？谢谢
2. 据说如果用p413这种质粒是不存在翻译时框移现象的，请问这是为什么？p413图谱见下，而且看起来这个图谱中promoter是在XbaI一侧啊，但是如果用XbaI/EcoRI这对酶切的话，会把EcoRI设计到Forword primer中，这个我又迷惑了，方向虽然看着两头都行，但是terminator明显在EcoRI这侧啊？EcoRI设计到Forword primer中克隆进去的基因不就放了吗？一直对基因复制的各种方向搞不清楚，请大家点播一二，谢谢。

质粒图谱与阅读框问题
413.jpg
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1楼 2014-09-30 01:05:24
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
xulinan: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2014-09-30 19:08:19
引用回帖:
8楼: Originally posted by xulinan at 2014-09-30 18:08:24
非常感谢你的回复，还是有些问题：
1. 我的Hsi tag前面是有ATG的，应该是his tag前多几个碱基没关系吧？按你的说法，his6前有ATG的话，前面多几个碱基是有影响的？混乱了....
2. Forward primer中包含的酶切位点 ...

1. 如果ATG-His-Tag前面没有没有其他ATG了，比如CCATG-His-Tag这种，怎么可能会出现CCA这种错误呢，翻译一定是从起始密码子开始，建议你多看看生化书

2. 不必纠结于Forward 还是reverse，子要你将你的序列顺着启动子的方向克隆在其下游就可以了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2014-09-30 18:39:42
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langzian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-09-30 12:31:59
xulinan: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-09-30 17:34:50
箭头是向两个方向画的，表明P T并不配对，翻译时从ATG起始，数好就没有问题的

[ 发自小木虫客户端 ]
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江山
2楼2014-09-30 03:44:35
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-09-30 12:32:03
xulinan: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-09-30 17:45:32
如果His tag在前面，那么后面无论怎么连接都不能改变His tag的表达（如果移码就没有His tag）
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3楼2014-09-30 11:05:24
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-30 12:32:06
xulinan: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-09-30 17:48:35
通常引物设计是酶切位点+His tag（如果纯化）+目的基因

GPD Promoters 是启动子。之后从ATG 开始翻译，你只需要在你的 His tag（如果纯化） 之前加上起始密码子就没有什么问题了。
Forword prime   位点应该是XbaI
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学习再学习，努力再努力。
4楼2014-09-30 11:17:47
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