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奇怪人生123银虫 (小有名气)
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求助！基因ORF与终止子的连接问题 已有4人参与
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各位大神，本菜鸟要构建一个质粒，骨架是pMCB17apx。 质粒上面有alcA启动子，后面紧跟一个gfp基因，我改造时，就在gfp后的合适位置，连接上了我的目的基因的完整ORF，但是现在缺少终止子。 虽然手头有trpC基因的终止子可用，但是导师交代连接终止子的时候需要注意的点有不少，我现在也很不清楚，不敢贸然直接去，有哪些大神能指点迷津啊？ 比如，用酶切的方法将终止子连接到目的基因后面，但是之间肯定会有几个无关的碱基（酶切位点），这有关系吗？导师指导说，目的基因和终止子之间，碱基数较多肯定不好，但是太少也会影响发挥作用，是否属实啊？求指点！！！ |
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Neo2000
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2楼2014-05-29 16:23:16
奇怪人生123
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5楼2014-08-21 17:11:31
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【答案】应助回帖
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看了不少回复，感觉都没太说到点子上。 你导师的提醒是对的，终止子和ORF之间的碱基个数是会影响到终止子的终止效率的，其理论基础便是翻译时核糖体（ribosome）在mRNA上如果和终止子形成的茎环结构（Stem-loop）太近的话会干扰茎环的形成从而造成通读（readthrough），太远的话由于转录惯性也会造成终止子的终止效应打折扣，一般20bp的距离为宜，正好两个DNA螺旋距离的长度。 详细的你可参考Joanna J.Wright等发表的文章：Transcriptional termination at a fully rho-independent site in Escherichia coli is prevented by uninterrupted translation of the nascent RNA. |
6楼2015-01-09 09:40:35
7楼2016-09-01 16:36:08
