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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 求推荐纯化大量质粒的填料
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sunshine436

新虫 (小有名气)

[求助] 求推荐纯化大量质粒的填料已有2人参与

有谁用自己装柱子的方法，纯化过大量质粒，要纯化100mg的质粒，想用买填料装柱子的方法降低kit成本，节省人力，有谁知道的话告诉我一下填料的货号和品牌，万分感谢！

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1楼2014-09-11 07:19:15
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒大提，请问你是要硅胶柱大提还是凝胶柱抽提

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sunshine436
2楼2014-09-11 07:34:24
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sunshine436

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by bio_sci at 2014-09-11 07:34:24
质粒大提，请问你是要硅胶柱大提还是凝胶柱抽提

我不太懂，哪个效果更好啊？求解

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3楼2014-09-11 07:45:12
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大批量质粒抽提纯化建议你用“碱裂解法”来抽提，配试剂很简单，配一次可以抽提大量质粒，用大的EP管一次就可以抽提相当量，质量纯度都很不错的。

试剂：
1. Solution I [50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,10mmol/L EDTA(PH8.0)]
2. Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SDS用前等体积汇合）
3. Solution III (5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5 mL,DH2O28.5mL)
4. TE缓冲液 (PH8.0)[10mmol/L Tris.HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)]
5. 0.5mo1／L (EDTA)
6. 氯仿：异戊醇（24：1）
7. Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24:1体积比）
8.  RTE (含20?0?8g/mLRNA酶A的TE缓冲液)  
实验步骤
1. 将3mL含Amp的LB液体培养基加入到试管中，接入含pGEM-T质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜；
2.将菌液加入1.5mL离心管中，4000r/min,5min,弃上清；重复一次，增加菌的收集量；
3.在离心管中加入100?0?8L溶液I,涡旋混匀，室温放置10min；
4.加入200?0?8L溶液II，轻轻混匀（颠倒5～10次），待逐渐变清亮后，冰浴2min（操作要轻柔，裂解时间不要超过5min）；
5.加入150?0?8L溶液III（冰上预冷的）加盖，轻轻颠倒混匀数次。在冰上静置15min让质粒DNA复性；
6.12000r/min离心10min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中；
7.向上清中加入等体积（约450?0?8L）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（去蛋白质和脂肪），手摇混匀，12000r/min离心5min，将上清移到另一个新的1.5mL离心管中（操作要平稳，不要将下边的有机相带上来）；
8.向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）（去微量酚和脂肪），轻轻颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中（不要将下边的有机相带上来）；
9.向上清中加入2倍体积的无水乙醇（冰冷的），混匀后，室温放置10min。12000r/min离心10min，弃上清；
10.加入1mL冰冷的70%乙醇，吸打悬浮，12000r/min离心2min，再重复一次。将离心管中的乙醇倒净，倒扣在滤纸上吸干，再置超净台上15min，让酒精挥发干净；
11.加20?0?8LRTE(含有RnaseA20?0?8g/mL的TE缓冲液)，使质粒溶解，-20℃保存。

仅供参考
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sunshine436
没有做不到，只有想不到！
4楼2014-09-11 14:32:31
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sunshine436

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王平阳 at 2014-09-11 14:32:31
大批量质粒抽提纯化建议你用“碱裂解法”来抽提，配试剂很简单，配一次可以抽提大量质粒，用大的EP管一次就可以抽提相当量，质量纯度都很不错的。

试剂：
1. Solution I
2. Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SD ...

谢谢您的建议，我们后续实验是做转染，要求的级别高，量很大，所以想用离子交换柱，连接自动仪器让它过夜自动上样，漂洗，洗脱，像蛋白纯化一样做法。想知道哪个填料更适合。

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5楼2014-09-11 15:17:23
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sunshine436 at 2014-09-11 15:17:23
谢谢您的建议，我们后续实验是做转染，要求的级别高，量很大，所以想用离子交换柱，连接自动仪器让它过夜自动上样，漂洗，洗脱，像蛋白纯化一样做法。想知道哪个填料更适合。
...

您好，请问你已经找到了大量纯化质粒的方法了么？我也准备大量纯化质粒...谢谢
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6楼2014-10-21 17:56:28
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小小cool

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-10-21 17:56:28
您好，请问你已经找到了大量纯化质粒的方法了么？我也准备大量纯化质粒...谢谢...

你好，我们有自己做的填料，专门用来大提质粒

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sunshine436 sunshine436
7楼2014-10-21 19:36:01
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小小cool at 2014-10-21 19:36:01
你好，我们有自己做的填料，专门用来大提质粒
...

您好，请问填料主要是什么？配比？用什么洗脱下来？检查方法？望赐教，十分感谢
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8楼2014-10-21 20:16:38
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

硅胶颗粒就行，或者大孔树脂

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9楼2014-10-21 20:47:34
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by bio_sci at 2014-10-21 20:47:34
硅胶颗粒就行，或者大孔树脂

您好，可否请你提供详细点的方案，非常感谢！
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10楼2014-10-21 21:04:03
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