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sunshine436新虫 (小有名气)
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求推荐纯化大量质粒的填料已有2人参与
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有谁用自己装柱子的方法，纯化过大量质粒，要纯化100mg的质粒，想用买填料装柱子的方法降低kit成本，节省人力，有谁知道的话告诉我一下填料的货号和品牌，万分感谢！ [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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sunshine436
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送红花一朵
13楼2014-10-21 21:09:24
2楼2014-09-11 07:34:24
sunshine436
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3楼2014-09-11 07:45:12
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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大批量质粒抽提纯化建议你用“碱裂解法”来抽提，配试剂很简单，配一次可以抽提大量质粒，用大的EP管一次就可以抽提相当量，质量纯度都很不错的。 试剂： 1. Solution I [50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,10mmol/L EDTA(PH8.0)] 2. Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SDS用前等体积汇合） 3. Solution III (5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5 mL,DH2O28.5mL) 4. TE缓冲液 (PH8.0)[10mmol/L Tris.HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)] 5. 0.5mo1／L (EDTA) 6. 氯仿：异戊醇（24：1） 7. Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24:1体积比） 8. RTE (含20?0?8g/mLRNA酶A的TE缓冲液) 实验步骤 1. 将3mL含Amp的LB液体培养基加入到试管中，接入含pGEM-T质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜； 2.将菌液加入1.5mL离心管中，4000r/min,5min,弃上清；重复一次，增加菌的收集量； 3.在离心管中加入100?0?8L溶液I,涡旋混匀，室温放置10min； 4.加入200?0?8L溶液II，轻轻混匀（颠倒5～10次），待逐渐变清亮后，冰浴2min（操作要轻柔，裂解时间不要超过5min）； 5.加入150?0?8L溶液III（冰上预冷的）加盖，轻轻颠倒混匀数次。在冰上静置15min让质粒DNA复性； 6.12000r/min离心10min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中； 7.向上清中加入等体积（约450?0?8L）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（去蛋白质和脂肪），手摇混匀，12000r/min离心5min，将上清移到另一个新的1.5mL离心管中（操作要平稳，不要将下边的有机相带上来）； 8.向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）（去微量酚和脂肪），轻轻颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中（不要将下边的有机相带上来）； 9.向上清中加入2倍体积的无水乙醇（冰冷的），混匀后，室温放置10min。12000r/min离心10min，弃上清； 10.加入1mL冰冷的70%乙醇，吸打悬浮，12000r/min离心2min，再重复一次。将离心管中的乙醇倒净，倒扣在滤纸上吸干，再置超净台上15min，让酒精挥发干净； 11.加20?0?8LRTE(含有RnaseA20?0?8g/mL的TE缓冲液)，使质粒溶解，-20℃保存。 仅供参考 |
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4楼2014-09-11 14:32:31