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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 启动子克隆前的PCR问题
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梅子清酒

木虫 (初入文坛)

[求助] 启动子克隆前的PCR问题 已有1人参与

用的是高保真酶扩增的，目标产物大小在1500左右，选用梯度PCR，梯度为50-60度，所选的温度比引物单上的已经小了很多，是去除前端之后重新计算的退火温度，但是为什么这样还是扩增不出来？Marker 是用DL5000
扩增的体系是（单位：微升）：
5*Primer Star Buffer      5
dNTP Mix                       2
Primer                          1+1
cDNA                            1.5
e                                  0.25
水                               13.75
扩增程序：
98                                3min
98                                10s
50-60                           15s
72                                2min
72                                10min
循环数是30

启动子克隆前的PCR问题
13448-16081.JPG
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1楼 2014-09-02 10:04:49
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-09-02 15:37:48
梅子清酒: 金币+2, ★有帮助, 恩！找到原因了，重新反转录了cDNA，这个东西很奇怪，之前合成的cDNA没有冻融过，但就是用不了。 2014-09-04 11:42:20
遇到很难解决的问题的时候，只能一项一项的分析排除：
1，模板问题，是不是模板存在阻碍PCR的成分；
2，引物问题，是不是引物设计不合理；
3，taq酶问题，是不是taq酶对于反应程序有特殊的要求；
4，操作问题，是不是有一些操作的细节还没注意。
这4个问题是常见的PCR问题，如果能够将模板/引物/taq/操作都一一确定无误，那么必定能够P出来。
希望实验成功。
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我不会！
3楼2014-09-02 13:53:52
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梅子清酒

木虫 (初入文坛)
求高手赐教。顶一下自己的
赞一下 回复此楼
2楼2014-09-02 12:29:23
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梅子清酒

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-09-02 13:53:52
遇到很难解决的问题的时候，只能一项一项的分析排除：
1，模板问题，是不是模板存在阻碍PCR的成分；
2，引物问题，是不是引物设计不合理；
3，taq酶问题，是不是taq酶对于反应程序有特殊的要求；
4，操作问题， ...

恩！找到原因了，重新反转录了cDNA，这个东西很奇怪，之前合成的cDNA没有冻融过，但就是用不了。
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4楼2014-09-04 11:41:31
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