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启动子克隆前的PCR问题 已有1人参与
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用的是高保真酶扩增的，目标产物大小在1500左右，选用梯度PCR，梯度为50-60度，所选的温度比引物单上的已经小了很多，是去除前端之后重新计算的退火温度，但是为什么这样还是扩增不出来？Marker 是用DL5000 扩增的体系是（单位：微升）： 5*Primer Star Buffer 5 dNTP Mix 2 Primer 1+1 cDNA 1.5 e 0.25 水 13.75 扩增程序： 98 3min 98 10s 50-60 15s 72 2min 72 10min 循环数是30  13448-16081.JPG |
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2楼2014-09-02 12:29:23
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-09-02 15:37:48
梅子清酒: 金币+2, ★有帮助, 恩！找到原因了，重新反转录了cDNA，这个东西很奇怪，之前合成的cDNA没有冻融过，但就是用不了。 2014-09-04 11:42:20
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遇到很难解决的问题的时候，只能一项一项的分析排除： 1，模板问题，是不是模板存在阻碍PCR的成分； 2，引物问题，是不是引物设计不合理； 3，taq酶问题，是不是taq酶对于反应程序有特殊的要求； 4，操作问题，是不是有一些操作的细节还没注意。 这4个问题是常见的PCR问题，如果能够将模板/引物/taq/操作都一一确定无误，那么必定能够P出来。 希望实验成功。 |
3楼2014-09-02 13:53:52
4楼2014-09-04 11:41:31