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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新手求助定量PCR具体实验方法，谢谢各位指点！
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炒饭达人

木虫 (初入文坛)

[求助] 新手求助定量PCR具体实验方法，谢谢各位指点！ 已有1人参与

求各位大神指点！

本人现在准备做荧光定量PCR，看了不少资料，但还是不太明白具体的实验步骤该怎么做。

目的是测定不同菌株（相同种类）之间数个基因的表达量差异，准备用相对定量的方法，内参基因选的是16sRNA。

细菌RNA已经提了，然后用的takala的盒子转录的DNA。接下来的实验就不明白具体怎么做了，仪器是ABI的Step ONE。

时间很紧，在下很菜，请各位不吝赐教！
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1楼 2014-08-28 00:24:55
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令狐少陈

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 炒饭达人 at 2014-08-28 09:29:58
谢谢您！
几个基因都跑了PCR，都能用。

反转录的时候RNA的量是参考盒子说明书加的，应该还好，而且有看到别人说相对定量的RNA不需要定量。

不明白的是接下来实验具体该怎么做。。。

是把DNA梯度稀释，然 ...

相对定量不需要标准曲线
RNA反转必须定量，保证起始模版一致
你可以先不稀释，做一个单孔，看看Ct大概在什么地方，如果很小就稀释。
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多多交流，海纳百川
4楼2014-08-28 11:11:09
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令狐少陈

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
炒饭达人(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-28 22:01:26
炒饭达人: 金币+17, ★★★★★最佳答案 2014-08-30 00:48:06
1,内参试过没？能用吗？
2，你的基因引物设计了吗？200bp左右，有没有普通pcr验证过
3，反转录的时候rna定量了吗？
如果以上都完成了，那你就可以像做普通pcr那样做了，不同的是
1，要用专门的酶，就是有SYBR的…
2.做阴性对照，和三个复孔
3,小心加样，减少加样误差，复孔Ct不得大于0.5
差不多就这些吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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多多交流，海纳百川
2楼2014-08-28 00:48:16
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炒饭达人

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 令狐少陈 at 2014-08-28 00:48:16
1,内参试过没？能用吗？
2，你的基因引物设计了吗？200bp左右，有没有普通pcr验证过
3，反转录的时候rna定量了吗？
如果以上都完成了，那你就可以像做普通pcr那样做了，不同的是
1，要用专门的酶，就是有SYBR的 ...

谢谢您！
几个基因都跑了PCR，都能用。

反转录的时候RNA的量是参考盒子说明书加的，应该还好，而且有看到别人说相对定量的RNA不需要定量。

不明白的是接下来实验具体该怎么做。。。

是把DNA梯度稀释，然后同时跑内参和目的基因的标准曲线吗？

谢谢！
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3楼2014-08-28 09:29:58
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littlefly1980

新虫 (初入文坛)
我也正在做细菌的荧光定量PCR，本来也想选16SrRNA做内参，可有人说16SrRNA做内参，国外的文章不接受，是这样吗？正发愁呢!
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5楼2014-10-13 13:13:25
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