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wxy1234yyf金虫 (小有名气)
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| 想用不含sigma因子的核心酶做体外转录，再另加入不同sigma因子来确定是哪种sigma因子介导转录。如何优化条件？我做了几次全失败，希望高人传授一下经验。 |
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2楼2014-08-06 16:03:52
wxy1234yyf
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先把RNA核心酶（Epicenter）和sigma因子（已脱咪唑）孵育，37度10min，再加入以下试剂： 5xtranscription buffer (0.2M Tris-HCl,ph7.5; 0.75M KCl, 50mM MgCl2, 0.05% TritoonX-100) 5ul NTP(10mM) 0.5ul DIG-UTP: 0.5ul 50U RNase inhibitor: 0.5ul BSA(10mg/ml): 0.25ul 肝素钠（12.5mg/ml）: 0.5ul DTT(0.2M): 0.25ul 加上500ng左右DNA模板，总体系25ul，37度反应20min。 RNA胶电泳无条带。 有些疑惑： 1. DNA模板是选用超螺旋质粒DNA还是PCR纯化的模板DNA 2. 查阅文献发现不同作者选用不同试剂，例如HEPES，谷氨酸钾，EDTA等等，不知对结果有什么影响 |
3楼2014-08-06 18:30:38
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4楼2014-08-06 18:41:01
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5楼2014-08-12 08:45:39