24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 6939  |  回复: 6

greenygreen

银虫 (小有名气)

[求助] 求助:T7体外转录已有1人参与

最近做的T7体外转录觉得效果不好,产率较低。胶回收之后几乎没啥东西了。我的模版不是PCR产物,而是公司合成的两条链退火之后做为模版。正义链5‘-3’是T7 promoter序列,反义链3’-5‘是和T7互补配对的序列,后面接上要转录的序列。
想请教大家如此的模版,20ul体系加入10pmol会不会太少呢?产率不高还有什么原因?模版示意图:

[ Last edited by greenygreen on 2013-1-23 at 20:32 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhzhemin

新虫 (初入文坛)

遇到同样的问题,求助~
2楼2013-10-24 22:36:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

real-time

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-25 10:04:09
我一直在做T7体外转录
但是做的不一样,我是PCR产物纯化后做的,浓度非常高
很可能是你的浓度不高引起的
建议你先用T7做一下PCR,纯化后再体外转录
一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
3楼2013-10-25 09:39:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

980979990

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by real-time at 2013-10-25 09:39:16
我一直在做T7体外转录
但是做的不一样,我是PCR产物纯化后做的,浓度非常高
很可能是你的浓度不高引起的
建议你先用T7做一下PCR,纯化后再体外转录

最近也在做结果一直不是很理想,能给一下你的转录体系参考吗?
4楼2014-01-05 09:46:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

你可以把这段序列,先连接到一个克隆载体上,然后设计一对引物扩增你要转录的这段序列,胶回收,这是的DNA量远比你合成回来的DNA量高,再做体外转录,能提高产物得率
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2014-01-05 15:29:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

real-time

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 980979990 at 2014-01-05 09:46:22
最近也在做结果一直不是很理想,能给一下你的转录体系参考吗?...

http://www.thermoscientificbio.c ... uct-information.pdf
我是按照这个说明书第6页操作的
一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
6楼2014-01-06 10:15:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18428388448

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by real-time at 2013-10-25 09:39:16
我一直在做T7体外转录
但是做的不一样,我是PCR产物纯化后做的,浓度非常高
很可能是你的浓度不高引起的
建议你先用T7做一下PCR,纯化后再体外转录

你好,请问你的PCR产物纯化之后的浓度是多少ng/uL啊?我是PCR胶回收的DNA,浓度为50ng/ul,T7转录需要1ug的DNA,我这个DNA浓度还是有点低吧?需要将DNA浓缩嘛?
7楼2021-11-12 21:29:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 greenygreen 的主题更新
信息提示
请填处理意见