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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

[求助] 重叠PCR 已有8人参与

做重叠PCR，最后一步怎么也合不到一起，两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度，touch down等，出来目的条带，但是非常淡，而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。
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1楼 2014-07-31 09:15:45
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shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-31 20:22:04
建议看一下重叠部分的TM值，overPCR能重叠的关键是重叠部分的退火温度,如果高了，两个片段粘不到一块自然就扩不出来你要的750bp的片段。你可以先重叠部分的TM减去2-5℃，10个循环，在用750bp的上下游引物的TM值-5摄氏度，20个循环试试。
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9楼2014-07-31 15:24:14
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:29
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。
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2楼2014-07-31 09:30:06
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 09:30:06
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。

嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗
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3楼2014-07-31 09:43:34
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-31 20:21:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 09:43:34
嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗...

如果PCR不好弄，可以增加overlap的长度，直接把两个小片段连到一起；或者以较弱的目的片段（750bp）的基础上再一次尝试扩增，反正750bp不容易产生突变。
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4楼2014-07-31 11:32:21
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:37
个人认为，首先楼主应确认overlap两个片段，A片段下游与B片段上游部分的序列是否相同，个人觉得应该有20-40bp左右的共同序列才能进行重叠；其次，在设计和成AB两个片段时，pcr产物是否单一，浓度多少，考虑是否要进行胶回收提纯，提纯后两片段浓度是多少；再次，根据DNA聚合酶的不同，所需要加入的两个片段的模板量也会不同，50微升体系中有的酶需要加100ng以上的模板，而有的酶只需要加几ng到20几ng；再有，体系中引物浓度是否适中，根据聚合酶的不同退火，延伸的温度都有不同，如退火50-60，延伸68-72等等，pcr反应循环数30-40或者再多。再者，楼主可以试着做下模板浓度梯度。祝楼主早日成功！
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5楼2014-07-31 11:45:47
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-07-31 11:45:47
个人认为，首先楼主应确认overlap两个片段，A片段下游与B片段上游部分的序列是否相同，个人觉得应该有20-40bp左右的共同序列才能进行重叠；其次，在设计和成AB两个片段时，pcr产物是否单一，浓度多少，考虑是否要进 ...

嗯嗯，序列确认过了，没问题的，片段也很纯，只是没测过浓度。很好的意见，值得参考，谢谢。也祝你一切顺利。
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6楼2014-07-31 11:59:13
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 11:32:21
如果PCR不好弄，可以增加overlap的长度，直接把两个小片段连到一起；或者以较弱的目的片段（750bp）的基础上再一次尝试扩增，反正750bp不容易产生突变。...

嗯，我试过用750的，效果更不好，另外做温度梯度感觉都一样，所以我觉得问题主要在模板浓度和引物浓度不适合，需要调整一下，多谢哈。
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7楼2014-07-31 12:02:37
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 12:02:37
嗯，我试过用750的，效果更不好，另外做温度梯度感觉都一样，所以我觉得问题主要在模板浓度和引物浓度不适合，需要调整一下，多谢哈。...

不用谢！
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8楼2014-07-31 12:04:34
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-31 20:22:12
两个片段要切胶纯化，而且要看得见条带，最好测一下浓度，把握好两个片段的比例，然后再一起P，祝你成功！
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10楼2014-07-31 16:19:07
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