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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠PCR
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-07-31 15:24:14
建议看一下重叠部分的TM值，overPCR能重叠的关键是重叠部分的退火温度,如果高了，两个片段粘不到一块自然就扩不出来你要的750bp的片段。你可以先重叠部分的TM减去2-5℃，10个循环，在用750bp的上下游引物的TM值-5摄 ...

可是我重叠部分退火温度是47，很低啊
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11楼2014-07-31 21:46:11
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by smdsfy at 2014-07-31 16:19:07
两个片段要切胶纯化，而且要看得见条带，最好测一下浓度，把握好两个片段的比例，然后再一起P，祝你成功！

必须切胶纯化吗，我的两个片段跑胶看的话也很纯，没有其他杂带
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12楼2014-07-31 21:47:06
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panhp2004

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
泡菜肉丝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:24:23
做融合 PCR 时，除了加A、B片段外，同时也加入 A 片段的上游引物及 B 片段的下游引物，50度退火，如有非特异性条带，再加 DMSO，尝试下可能有用。
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追梦是一个快乐的过程。
13楼2014-07-31 22:22:27
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by panhp2004 at 2014-07-31 22:22:27
做融合 PCR 时，除了加A、B片段外，同时也加入 A 片段的上游引物及 B 片段的下游引物，50度退火，如有非特异性条带，再加 DMSO，尝试下可能有用。

试过了，不行，今天又用重合的短引物看看吧，要加DMSO的浓度是多少呢？我做的是20ul体系。
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14楼2014-07-31 22:28:16
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shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 21:46:11
可是我重叠部分退火温度是47，很低啊...

我前几天刚扩增过一个重叠部分TM为48℃的，我用45℃退火，10个循环，再用重叠后的大片段的上下游引物56℃（引物合成后TM=61℃）20个循环，扩增的挺好的，如果有 非特异性扩增则切胶回收。
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15楼2014-07-31 23:23:50
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-07-31 23:23:50
我前几天刚扩增过一个重叠部分TM为48℃的，我用45℃退火，10个循环，再用重叠后的大片段的上下游引物56℃（引物合成后TM=61℃）20个循环，扩增的挺好的，如果有 非特异性扩增则切胶回收。...

哦，这样啊，我之前试的都是温度梯度和touch down，没有像你这样先一个温度循环后再一个温度循环。很值得参考，谢谢。
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16楼2014-07-31 23:32:33
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-07-31 23:23:50
我前几天刚扩增过一个重叠部分TM为48℃的，我用45℃退火，10个循环，再用重叠后的大片段的上下游引物56℃（引物合成后TM=61℃）20个循环，扩增的挺好的，如果有 非特异性扩增则切胶回收。...

对了，能说一下你的具体程序吗，呵呵
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17楼2014-07-31 23:33:57
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shyh1983

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 23:33:57
对了，能说一下你的具体程序吗，呵呵...

假设：A基因的引物为A1/A2,B基因的引物为B1/B2,A2/B1中重叠部分的TM=48℃，A1/B2的TM=61℃，按正常PCR体系，20ul体系。
step1：不加引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 5min
5个循环
step2：在上述体系中加入A1/B2上下游引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 7min
10个循环
step3：
94℃ 3min
94℃ 30s
56℃ 30s
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 7min
20个循环；
祝你好运！
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18楼2014-08-01 09:59:49
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xxooxxoo

新虫 (初入文坛)
同学 ，你那里的啊，我也在做重叠pcr，方便的话联系一下，相互学习一下！
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19楼2014-08-01 10:48:02
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leonaliu2013

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重叠PCR引物特别重要，我同时做四个片段，两两重叠，有两个一次就成功了，另外两个一个多月了，还融不上。就是引物特异性不好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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20楼2014-08-01 10:56:48
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