应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠PCR
51/1返回列表
查看: 2030  |  回复: 38
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

[求助] 重叠PCR 已有8人参与

做重叠PCR，最后一步怎么也合不到一起，两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度，touch down等，出来目的条带，但是非常淡，而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢
1楼 2014-07-31 09:15:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-31 20:22:04
建议看一下重叠部分的TM值，overPCR能重叠的关键是重叠部分的退火温度,如果高了，两个片段粘不到一块自然就扩不出来你要的750bp的片段。你可以先重叠部分的TM减去2-5℃，10个循环，在用750bp的上下游引物的TM值-5摄氏度，20个循环试试。
赞一下(2人) 回复此楼
9楼2014-07-31 15:24:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 21:46:11
可是我重叠部分退火温度是47，很低啊...

我前几天刚扩增过一个重叠部分TM为48℃的，我用45℃退火，10个循环，再用重叠后的大片段的上下游引物56℃（引物合成后TM=61℃）20个循环，扩增的挺好的，如果有 非特异性扩增则切胶回收。
赞一下 回复此楼
15楼2014-07-31 23:23:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shyh1983

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 23:33:57
对了，能说一下你的具体程序吗，呵呵...

假设：A基因的引物为A1/A2,B基因的引物为B1/B2,A2/B1中重叠部分的TM=48℃，A1/B2的TM=61℃，按正常PCR体系，20ul体系。
step1：不加引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 5min
5个循环
step2：在上述体系中加入A1/B2上下游引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 7min
10个循环
step3：
94℃ 3min
94℃ 30s
56℃ 30s
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 7min
20个循环；
祝你好运！
赞一下 回复此楼
18楼2014-08-01 09:59:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shyh1983

金虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-08-01 11:19:24
哦，是不是我理解错了，你说的循环还是和普通的一样，每一步的234小步循环，之后72℃ 7min，是这样吧？...

是的
回复此楼
28楼2014-08-01 11:48:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 泡菜肉丝 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭