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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠PCR
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)

[求助] 重叠PCR 已有8人参与

做重叠PCR，最后一步怎么也合不到一起，两个片段一个三百多一个四百多。做了各种梯度，touch down等，出来目的条带，但是非常淡，而且靠近一百左右有一条小带。希望有经验的朋友帮忙。
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1楼 2014-07-31 09:15:45
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shyh1983

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 23:33:57
对了，能说一下你的具体程序吗，呵呵...

假设：A基因的引物为A1/A2,B基因的引物为B1/B2,A2/B1中重叠部分的TM=48℃，A1/B2的TM=61℃，按正常PCR体系，20ul体系。
step1：不加引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 5min
5个循环
step2：在上述体系中加入A1/B2上下游引物
94℃ 3min
94℃ 30s
45℃ 1min
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 7min
10个循环
step3：
94℃ 3min
94℃ 30s
56℃ 30s
72℃ 1min 30s（我重叠后的片段1200bp）
72℃ 7min
20个循环；
祝你好运！
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18楼2014-08-01 09:59:49
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 14:00:29
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。
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2楼2014-07-31 09:30:06
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泡菜肉丝

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 09:30:06
应该是做overlap PCR吧？不知道你overlap的序列多长？模板浓度如何？另外，100bp左右的条带如果是一坨，可能是引物。

嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗
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3楼2014-07-31 09:43:34
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-31 20:21:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by 泡菜肉丝 at 2014-07-31 09:43:34
嗯，是的，序列大概在750左右，模板浓度没有测过，但是能清晰的看到，也不低，我觉得也是引物，现在是尝试各种都不行，P出来的条带都很暗...

如果PCR不好弄，可以增加overlap的长度，直接把两个小片段连到一起；或者以较弱的目的片段（750bp）的基础上再一次尝试扩增，反正750bp不容易产生突变。
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4楼2014-07-31 11:32:21
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